已經(jīng)開發(fā)了以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）為基礎(chǔ)的方法來區(qū)分糖肽的核心-和天線-巖藻糖的糖基化。通過完整的糖肽分析可以解析不同的糖基化位點(diǎn)（異質(zhì)性）以及每個位點(diǎn)上可能存在的多種糖鏈（微觀異質(zhì)性）。本研究中使用含有核心-和天線-巖藻糖糖基化位點(diǎn)的血清糖蛋白α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）。使用唾液酸酶去除唾液酸以簡化糖基化的微觀異質(zhì)性，并可以增強(qiáng)具有類似糖鏈結(jié)構(gòu)糖肽的MS信號。使用β1-3,4半乳糖苷酶來區(qū)分核心-和天線-巖藻糖基化。我們發(fā)現(xiàn)源內(nèi)裂解嚴(yán)重影響低豐度糖鏈修飾的糖肽鑒定和定量。因此需要對質(zhì)譜儀參數(shù)進(jìn)行設(shè)定以最小化源內(nèi)裂解。使用三步法質(zhì)譜裂解策略進(jìn)行糖肽的識別，并通過pGlyco軟件注釋和人工檢查進(jìn)一步確定。用于初始糖肽片段化的碰撞能量對提高氧鎓離子的檢測以及更好地選擇Y1離子（肽+GlcNAc）至關(guān)重要。結(jié)構(gòu)配置顯示A1AT糖肽的所有3個糖基化位點(diǎn)都含有復(fù)雜的N-糖鏈結(jié)構(gòu)：Asn70位點(diǎn)含有沒有巖藻糖基化的二天線糖鏈；Asn107位點(diǎn)含有核心-和天線-巖藻糖基化的二天線，三天線和四天線糖鏈；Asn271位點(diǎn)含有核心-和天線-巖藻糖基化的二天線和三天線糖鏈。Asn107位點(diǎn)上的核心-和天線-巖藻糖基化的相對強(qiáng)度與A1AT蛋白相似，表明Asn107位點(diǎn)的糖基化水平比其他2個位點(diǎn)高得多。

       1.前言

       異常蛋白質(zhì)的糖基化尤其是巖藻糖基化與各種疾病相關(guān)，例如癌癥[1]。核心巖藻糖基化是指巖藻糖連接到N-糖鏈的核心-N-乙酰葡糖胺上形成的，而天線巖藻糖基化則是巖藻糖連接到天線-N-乙酰葡糖胺或半乳糖上形成的。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)的核心-或天線-巖藻糖基化的變化指示各種癌癥的發(fā)生。例如，血清中α-胎兒球蛋白（AFP-L3）的核心-巖藻糖基化水平的增加被發(fā)現(xiàn)與肝細(xì)胞癌有關(guān)[2]。基于免疫分析法和LCA對核心-巖藻糖基化糖蛋白的高親和力，AFP-L3使用小扁豆凝集素（LCA）印跡試驗(yàn)進(jìn)行檢測[3]。另一個例子是CA19-9，一種天線-巖藻糖基化唾液酸化路易斯A（lewis A）結(jié)構(gòu)。血清中CA19-9水平的升高是胰 腺癌最廣泛使用的臨床指標(biāo)[4]。使用唾液酸化路易斯A結(jié)構(gòu)的特異性抗體通過免疫分析法來檢測CA19-9[4]。該方法依賴于特異性抗體，因此不能輕易應(yīng)用于其他糖蛋白。除了上述基于免疫分析法的方法之外，用于核心-和天線-巖藻糖基化分析的另一種常規(guī)方法涉及各種巖藻糖苷酶的組合以及從糖蛋白中釋放糖鏈后通過HPLC對糖鏈進(jìn)行幾個循環(huán)的分離[5]。盡管最近開發(fā)的固定化PNGase F消化程序使糖鏈可以從糖蛋白中快速釋放[6]，但該巖藻糖苷酶消化的方法是冗長的。更重要的是，大多數(shù)蛋白質(zhì)具有多個巖藻糖基化位點(diǎn)，上述分析丟失了位點(diǎn)特異性信息，因此不能提供蛋白質(zhì)的核心-或天線-巖藻糖基化異常的直接證據(jù)，而該證據(jù)是精準(zhǔn)診斷的關(guān)鍵。

       許多研究一直在探索基于MS的完整糖肽分析，例如改善質(zhì)譜儀的靈敏度，分辨率和裂解模式以及開發(fā)用于糖肽數(shù)據(jù)分析的軟件[7,8]。這些研究過程中一直使用CID，ECD，ETD，EThcD，低能量和高能量HCD等裂解方式或這些裂解方式的組合來闡明糖肽的結(jié)構(gòu)[9-11]。已經(jīng)開發(fā)了用于闡明這些譜圖的幾種不同軟件，其中Byonics[12]和GPQuest[13]是目前使用最廣泛的軟件。然而Byonics依賴于基于肽段序列的得分，低估了糖肽的假陽性發(fā)現(xiàn)率[14]，GPQuest需要一個樣品來源的肽數(shù)據(jù)庫來匹配糖肽，這使得實(shí)驗(yàn)更加復(fù)雜[13]。在這里，我們使用了Yang PY和He SM團(tuán)隊中新開發(fā)的pGlyco軟件來幫助糖肽的質(zhì)譜分析。pGlyco使用HCD MS2產(chǎn)生的氧鎓離子來過濾糖肽，在Y1離子上使用HCD MS3進(jìn)行肽段測序，并使用CID MS2進(jìn)行糖鏈的解析[15]。pGlyco2.0是一個更新版本，它使用了階梯式HCD碰撞[14]。雖然pGlyco中MS3的參與使得掃描速度稍慢，但與pGlyco 2.0相比，它能夠手動檢查具有更復(fù)雜片段的糖鏈結(jié)構(gòu)和肽段序列。因此，我們使用pGlyco作為首選方法。

       單獨(dú)使用LC-MS/MS，由于它們在C18色譜柱上相似的保留時間和糖肽相同的質(zhì)核比[16]，因此通常難以區(qū)分核心-和天線-巖藻糖基化，并且在MS/MS裂解過程中巖藻糖可能發(fā)生從天線-到核心-位置的遷移[17]。糖鏈衍生化例如全甲基化能夠解決巖藻糖遷移的問題，但是在衍生化之前需要從糖肽中釋放糖鏈，以致位點(diǎn)特異性信息丟失[17,18]。因此，我們試圖開發(fā)一種在進(jìn)行LC-MS/MS之前區(qū)分核心-和天線-巖藻糖基化的方法，并使用pGlyco促進(jìn)核心-和天線-巖藻糖基化鑒定和半定量的質(zhì)譜分析。在本研究質(zhì)譜分析前，我們應(yīng)用唾液酸酶和半乳糖苷酶雙重消化來區(qū)分核心-和天線-巖藻糖基化。使用唾液酸酶去除唾液酸以簡化糖基化微觀異質(zhì)性并增強(qiáng)糖肽的MS信號。β 1-3,4半乳糖苷酶（來自牛睪丸）用于區(qū)分核心-和天線-巖藻糖基化，其中半乳糖苷酶不能從天線-巖藻糖基化的路易斯結(jié)構(gòu)釋放半乳糖[19]。

       血清蛋白α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）的巖藻糖基化水平已被確定為各種癌癥[20,21]和炎癥[22]的潛在生物標(biāo)志物。本研究中，糖肽的唾液酸酶和半乳糖苷酶雙重消化之后直接進(jìn)行LC-MS/MS分析，而不從糖肽中釋放糖鏈。通過對A1AT的糖肽的成功鑒定和半定量以及核心-和天線-巖藻糖基化的明確區(qū)分，解析了糖基化位點(diǎn)和每個位點(diǎn)上多種可能的糖鏈。

       2.材料方法

       2.1胰蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成肽段：我們向10μg α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）中加入10μL 50mM的碳酸氫氨并用移液器吹打充分溶解樣品。溶解的A1AT樣品用10mM tris（2-羧乙基）磷化氫（TCEP）在37℃下還原30分鐘并用20mM碘乙酰胺（IAA）在室溫下避光烷基化15分鐘。用50mM碳酸氫氨將樣品溶液稀釋3倍，加入1μL 0.5μg/μL的胰蛋白酶（Promega，Madison，WI）在37℃下孵育16小時。最后95℃下孵育5分鐘使胰蛋白酶失活并通過真空離心機(jī)干燥樣品。

       2.2糖肽的富集和緩沖液置換：使用3K Ultra離心過濾器-15（Millipore Amicon）進(jìn)行糖肽富集和緩沖液置換。離心機(jī)設(shè)置為7,500g，1小時，重復(fù)3次將緩沖體系由上述體系置換為25mM的乙酸鈉（pH5.5）。修飾的糖肽大于3K，因此只有小于3K的非糖肽類才能透過3K濾膜。

       2.3唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化：對于唾液酸酶和半乳糖苷酶消化，將30μL 25mM乙酸鈉溶液中的糖肽混合物與15mU（3μL）來自大腸桿菌（(Prozyme, Hayward, CA)）中表達(dá)的非特異性α2-3,6,8,9唾液酸重組酶以及75mU（3μL）來自牛睪丸（Prozyme，Hayward，CA）的β1-3,4半乳糖苷酶在37℃下溫育18小時以除去所有唾液酸酸殘基和半乳糖，前提是巖藻糖沒有連接到N-糖鏈末端的N-乙酰葡糖胺上。糖苷酶在95℃下5分鐘失活。

       2.4 C18脫鹽：加入三氟乙酸（TFA）直到pH值達(dá)到2。用200μL含有0.1％TFA的50％乙腈溶液活化C18柱（Fisher Scientific，San Jose，CA）5次，并用0.1％的TFA水溶液平衡3次，每次1500g/min離心1min。將多肽與C18珠子結(jié)合5次，然后用0.1％的TFA洗滌3次通過上述離心程序去除非特異性結(jié)合；使用20μL含有0.1％TFA的50％乙腈溶液通過上述離心程序進(jìn)行洗脫。重復(fù)洗脫一次，然后通過真空離心機(jī)干燥合并的洗脫液。

       2.5 糖肽的LC-MS鑒定

       Nano LC-MS/MS工作條件如先前研究中所述[23]。C18毛細(xì)管柱（100μm×15cm；3μm粒徑，200?)）（Thermo Fisher Scientific，SanJose，CA）用于LC分離，梯度洗脫使用Ultimate 3000 nanoLC系統(tǒng)（Thermo Fisher Scientific，SanJose，CA），流速為350nL/min。流動相A為0.1％的甲酸水溶液中含有2％的乙腈，流動相B為乙腈溶液中含有0.1％的甲酸和2％的水。分析方法的梯度時長100分鐘，其中平衡10分鐘后，流動相B的梯度組成為：2min內(nèi)由3％上升到7％，8min內(nèi)再從7％上升到14％，55min內(nèi)從14％上升到25％隨后進(jìn)行洗滌和平衡步驟：其中流動相B在5min內(nèi)增加至90％并保持8min，然后在0.1min內(nèi)返回至3％并保持17min。

       使用以正離子模式操作的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司，圣荷西，美國加州）進(jìn)行分析。ESI噴霧電壓和毛細(xì)管電壓的設(shè)定如下文所述。對每個樣品進(jìn)行兩次LC-MS分析。每次運(yùn)行包括兩個連續(xù)的MS掃描類型。在第一次運(yùn)行中，通過低能量HCD MS2檢測氧鎓離子138.05來選擇糖肽；來自糖肽的Y1離子（肽+GlcNAc）通過高能量HCD MS3用于肽段測序。在第二次運(yùn)行中，在通過低能HCD MS2選擇糖肽后，將所選擇的糖肽進(jìn)行CID MS2用于糖鏈的結(jié)構(gòu)分析。正如結(jié)果部分所討論的那樣，為了更好地檢測氧鎓離子，更好地選擇Y1離子以及更好地裂解Y1離子和糖鏈，每個裂解步驟的碰撞能量也進(jìn)行了優(yōu)化。全掃描定義質(zhì)量范圍為m/z 600到1800，MS/MS采用速度模式。

       2.6 糖肽鑒定的數(shù)據(jù)庫檢索:

       He SM團(tuán)隊開發(fā)的搜索引擎pGlyco和pFind用于糖蛋白的分析。兩次LC-MS運(yùn)行的原始數(shù)據(jù)首先需要一致以確保兩次運(yùn)行中相同前體離子的保留時間相同。pFind通過使用來自第一次LC-MS運(yùn)行的MS3譜圖來進(jìn)行Y1肽段鑒定：（1）固定化修飾：半胱氨酸的脲基甲基化（+57.021Da）；（2）動態(tài)修飾：甲硫氨酸氧化（+15.995Da）和N-乙酰己糖胺（+203.075Da）；（3）允許錯過一次裂解；（4）肽段離子公差：15ppm；（5）碎片離子公差：25ppm。從第一次LC-MS運(yùn)行中鑒定的Y1肽段和第二次LC-MS運(yùn)行的原始數(shù)據(jù)被輸入到pGlyco中進(jìn)行糖肽匹配和評分。所有鑒定的糖肽均由EURO CarbDB開發(fā)的GlycoWorkbench軟件進(jìn)行手動檢查[24]。根據(jù)糖生物學(xué)基礎(chǔ)[25]使用糖鏈的命名規(guī)則，根據(jù)NIBRT GlycoBase使用縮寫。

       3.結(jié)果與討論

       N-連接糖蛋白的兩種巖藻糖基化結(jié)構(gòu)，核心-和天線-巖藻糖基化，已被認(rèn)為是各種癌癥中的生物標(biāo)志物[1]。通常很難區(qū)分這兩種結(jié)構(gòu)。因此，我們試圖開發(fā)一種方法來區(qū)分目標(biāo)蛋白的每個糖基化位點(diǎn)上的核心-和天線-巖藻糖基化。本研究的工作流程如圖1所示。簡而言之，將血清蛋白α-1抗胰蛋白酶（A1AT）標(biāo)準(zhǔn)品消化成肽段，然后通過唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化處理用于糖基的切除。將處理后的糖肽半富集并通過3K濾膜脫鹽后直接通過LC-MS/MS進(jìn)行分析。因此A1AT的核心-和天線-巖藻糖基化被成功地區(qū)分和定量。

       血清蛋白的總體巖藻糖基化水平相當(dāng)?shù)蚚26]。利用用于肽分析的常規(guī)質(zhì)譜設(shè)置，將發(fā)生糖肽的源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)的解離（也稱為噴霧分離器解離，在此縮寫為源內(nèi)解離）。這是離子從大氣壓離子源轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀的真空室期間由于碰撞激發(fā)而導(dǎo)致解離的過程[27]。在我們的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)糖肽的源內(nèi)解離嚴(yán)重影響低豐度巖藻糖基化肽段的鑒定和半定量。但是，迄今為止還沒有對這個問題進(jìn)行詳細(xì)分析。以A1AT糖肽中最豐富的糖基修飾類型A2為例，A2在唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后應(yīng)含有3個Hex（甘露糖），4個HexNAc（N-乙酰葡糖胺），0個NeuAc，0個NeuGlc和0個dHex，在這里簡寫為34000。如圖2所示，使用賽默飛開發(fā)的Orbitrap Fusion質(zhì)譜儀（離子傳輸管溫度=300℃，RF=30%）[28]，通過“常規(guī)”方法設(shè)定或更嚴(yán)格的設(shè)定進(jìn)行肽段分析發(fā)現(xiàn)超過20%的34000糖鏈被衰減到23000（以XIC23000 / XIC34000計算）。因此優(yōu)化了用于糖肽分析的一系列MS設(shè)定。我們發(fā)現(xiàn)在較低溫度和較低的RF（150℃，20%）條件下，糖肽的源內(nèi)解離降低到3%以下，而含有34001糖鏈的核心-巖藻糖基化肽段的信號沒有顯著降低。我們還發(fā)現(xiàn)，較高的噴霧電壓（噴霧電壓> 2300 V）會提供更高的信號，但同時也增加了源內(nèi)解離。因此使用穩(wěn)定噴霧的噴霧電壓2300 V。該優(yōu)化的設(shè)定條件用于進(jìn)一步鑒定A1AT糖肽的位點(diǎn)特異性糖基化以及對核心-和天線-巖藻糖基化進(jìn)行半定量。

       圖3顯示了直接的LC-MS/MS策略，首先通過用低能HCD MS2檢測氧鎓離子138.05來選擇糖肽（圖3A）；然后將來自糖肽片段的Y1離子進(jìn)行高能量HCD MS3（圖3B）用于肽段測序；而所選擇的糖肽進(jìn)行CID MS2（圖3C）用于糖鏈的結(jié)構(gòu)分析；圖3D中總結(jié)了整個流程。第一步的HCD碰撞能量（CE）對糖肽的片段化至關(guān)重要。它針對提高氧鎓離子的檢測和Y1離子的選擇進(jìn)行了優(yōu)化。如圖4所示，對于含有Asn271位點(diǎn)的非巖藻糖基化以及核心-巖藻糖基化或天線-巖藻糖基化的二天線糖肽，當(dāng)CE為24（從CE20到CE32的一系列HCD中）時的低能量HCD MS2提供了最強(qiáng)的Y1離子片段。這種最適的CE似乎與糖鏈結(jié)構(gòu)或肽段序列無關(guān)。如糖肽（含有Asn271位點(diǎn)）所示，無論是非巖藻糖基化還是核心-巖藻糖基化或天線-巖藻糖基化結(jié)構(gòu)都具有相同的最適CE（圖4），其中AlAT的其他2種糖肽（含有Asn107或Asn70位點(diǎn)）也具有相同的最適CE（補(bǔ)充信息-圖S1）。

       與此相反，第二步用于肽注釋的HCD CE和第三步用于糖鏈注釋的CID CE靈敏度卻不高。當(dāng)CE為35、38或40時，HCD MS3均顯示出相似的裂解模式（如圖5所示），其中HCD MS3 CE35對較高m/z的片段產(chǎn)生的信號稍強(qiáng)。糖肽的糖鏈結(jié)構(gòu)在CID CE30和CE35下均顯示出相似的裂解模式（圖6）。因此在隨后的實(shí)驗(yàn)中，分別使用低能量HCD CE24，CID CE30和高能量HCD CE 35。

       唾液酸酶釋放α 2-3,6,8,9-N-乙酰神經(jīng)氨酸，導(dǎo)致N-糖鏈的末端變?yōu)榘肴樘?。隨后，β-半乳糖苷酶切除β 1-3,4半乳糖，前提是沒有巖藻糖與N-糖鏈末端N-乙酰葡糖胺結(jié)合，因此提供了區(qū)分核心-巖藻糖基化和天線-巖藻糖基化的方法[19]。在唾液酸酶消化的樣品中核心-巖藻糖基化和天線-巖藻糖基化糖肽具有相同的m/z（圖7.B），因此唾液酸酶消化樣品的圖譜是核心-和天線-巖藻糖基化肽段的混合物（圖7.B1）。相比之下，唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化的樣品中核心-和天線-巖藻糖基化肽段具有不同的m/z（圖7.A）。因此，使用唾液酸酶/半乳糖苷酶對糖肽進(jìn)行雙重消化后，不需要進(jìn)一步的MS/MS分析或大量連續(xù)的外切糖苷酶消化就可以區(qū)分出兩種類型的巖藻糖基化，這與之前在糖鏈水平上的工作相似[19]。此外，用唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后，天線-巖藻糖基化糖肽的保留時間早于其相應(yīng)的核心-巖藻糖基化糖肽（圖7.A），表明半乳糖增強(qiáng)了其親水性。我們發(fā)現(xiàn)核心-和天線-巖藻糖基化糖肽的洗脫時間和裂解模式都不相同。在核心-巖藻糖基化糖肽的CID MS/MS圖譜中，可以觀察到幾個核心-巖藻糖基化糖肽片段（圖7.A1）；而在天線-巖藻糖基化糖肽的CID MS/MS圖譜中出現(xiàn)的三個信號最強(qiáng)的片段為pep-43001，pep-43000和pep-33001（圖7.A2）。其他糖肽中也發(fā)現(xiàn)了核心-和天線-巖藻糖基化裂解模式的差異（圖S2）。因此，使用唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后，可以通過直接LC-MS/MS分析獲得核心-和天線-巖藻糖基化肽段之間的穩(wěn)定差異。傳統(tǒng)的外切糖苷酶與巖藻糖苷酶α 1-2,3,4,6和巖藻糖苷酶α 1-3,4也可以進(jìn)一步應(yīng)用于唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化的糖肽，顯示了該策略的有效性（圖S3）。

       在之前的研究中，我們分析了從糖蛋白A1AT上釋放的糖鏈，發(fā)現(xiàn)A1AT在唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后有12種不同的糖鏈結(jié)構(gòu)[19]。在本研究中，我們鑒定了10個特定糖基化位點(diǎn)上的這些結(jié)構(gòu)。它們在C18色譜柱上的保留時間及其相對強(qiáng)度如表1所示。在補(bǔ)充信息-圖S2中顯示了所有鑒定糖肽的低能量HCD MS2，高能量MS3和CID MS2圖譜。含有Asn107位點(diǎn)的糖肽1 ADTHDEILEGLNFnLTEIPEAQIHEGFQELLR（修飾的氨基酸顯示為小寫）具有最多種類的糖鏈修飾類型，包括A2，F(xiàn)A2，A2FG，A3，F(xiàn)A3，A3FG，A4，F(xiàn)A4，A4FG，A3F2G2，而其他兩個位點(diǎn)具有比較少的糖鏈修飾類型（含有Asn271位點(diǎn)的糖肽2YLGnATAIFFLPDEGK：A2，F(xiàn)A2，A2FG，A3，A3FG和含有Asn70位點(diǎn)的糖肽3 QLAHQSnSTNIFFSPVSIATAFAMLSLGTK：A2）。每個位點(diǎn)的糖基化程度可能取決于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或者位點(diǎn)與某些氨基酸或N/C末端的接近程度[22]。如圖8（晶體結(jié)構(gòu)來自[29]）所示，所有三個位點(diǎn)都位于蛋白質(zhì)表面和環(huán)中，其中Asn107幾乎位于大環(huán)的中心，并且可能更易接近各種糖基轉(zhuǎn)移酶，而Asn271和Asn70更接近α螺旋或β折疊結(jié)構(gòu)并且空間較小。這可能在某些方面解釋了為什么Asn107具有最多的糖基化修飾類型。

       正如預(yù)期所示，在唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后，核心-巖藻糖基化糖肽額外的巖藻糖使得糖肽更具親水性，因此其從C18柱的洗脫早于其相應(yīng)的二天線-和三天線糖鏈修飾的非巖藻糖基化糖肽。與相應(yīng)的核心-巖藻糖基化的情況相比，額外的半乳糖使天線-巖藻糖基化的二天線糖肽更加親水。然而，進(jìn)一步的半乳糖和/或巖藻糖沒有使得三-或四-天線糖肽更加親水，并且所有巖藻糖基化的三天線糖肽或四天線糖肽在非常緩慢的洗脫梯度（0.2%ACN /min）下洗脫時間相似。這表明在唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化后，糖肽的疏水性主要由其肽骨架決定，只在二天線糖鏈中發(fā)現(xiàn)有輕微的疏水性變化。這種變化可能是由于與三天線-和四天線-糖鏈相比，二天線糖鏈具有較少的糖基，因此一個或兩個額外的糖基就可以導(dǎo)致糖肽總體疏水性更高。

       我們先前對糖鏈的研究表明，非巖藻糖基化的二天線-和三天線-糖鏈?zhǔn)茿1AT中最豐富的兩個糖鏈結(jié)構(gòu)，分別占35.8％和25.2％[19]。在糖肽1和糖肽2的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Asn107上的二天線-和三天線-糖鏈修飾分別占48％和34％，而在Asn271上分別為97％和1％（表1）。糖肽3的分析顯示Asn70上僅有A2糖鏈修飾；因此我們認(rèn)為Asn70上的糖鏈修飾對A1AT蛋白的整體糖基化沒有多少貢獻(xiàn)。卡方檢驗(yàn)用于比較從A1AT蛋白質(zhì)釋放的糖鏈類型（數(shù)據(jù)來源于以前的結(jié)果[19]）和糖肽1（含有Asn107位點(diǎn)）的糖鏈修飾類型或糖肽2（含有Asn271位點(diǎn)）的糖鏈修飾類型（表2）之間的主要糖鏈修飾類型的相對峰強(qiáng)度。從A1AT蛋白釋放的糖鏈類型與Asn271上的糖鏈修飾類型顯著不同（p值一項經(jīng)典的凝集素印跡試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，核心-巖藻糖基化而非天線-巖藻糖基化的A1AT的上調(diào)可以作為肝細(xì)胞癌診斷的指標(biāo)[20]，而A1AT的天線-巖藻糖基化可以作為炎癥發(fā)生的指標(biāo)，尤其是在HBV感染的患者中[22]。我們先前的糖鏈研究表明，二天線-核心-巖藻糖基化是A1AT蛋白質(zhì)中最豐富的核心-巖藻糖基化類型。從表1中我們可以推斷，如果患者的A1AT核心-巖藻糖基化類型發(fā)生改變，Asn107位點(diǎn)上的二天線-核心-巖藻糖基化很可能是通過質(zhì)譜法進(jìn)行精確監(jiān)測和定量的合適目標(biāo)。另一種經(jīng)典的基于凝集素印跡的研究表明，A1AT巖藻糖基化水平的總體升高能夠區(qū)分肺腺癌與良性病變或其他肺癌亞型[21]。本研究中開發(fā)的策略將能夠鑒定和定量A1AT特定位點(diǎn)上的核心-和天線-巖藻糖基化。在今后的工作中，這種方法將被用于研究各種癌癥發(fā)展過程中血清A1AT糖基化的變化。包括特異性位點(diǎn)信息的更精確的巖藻糖基化分析能夠提供更高的診斷價值。此外，該策略可應(yīng)用于各種疾病發(fā)展期間其他關(guān)鍵糖蛋白的研究。

       4.結(jié)論

       我們已經(jīng)開發(fā)了一條渠道來研究A1AT的糖基化，以確定核心-與天線-巖藻糖基化的存在，而不用從糖肽中分離糖鏈和肽段。這是在A1AT蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品上進(jìn)行的，該蛋白質(zhì)經(jīng)胰蛋白酶酶切，隨后進(jìn)行唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化。除了末端N-乙酰葡糖胺被巖藻糖基化修飾外，半乳糖苷酶可以去除N-糖鏈中的末端半乳糖殘基，從而提供區(qū)分核心-巖藻糖基化和天線-巖藻糖基化的手段。糖鏈的位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)可以通過該方法同時鑒定。我們在糖肽QLAHQSnSTNIFFSPVSIATA的Asn70位點(diǎn)上鑒定了1個糖鏈結(jié)構(gòu)（A2），在糖肽ADTHDEILEGLNFnLTEIPEAQIHEGFQELLR的Asn107位點(diǎn)上鑒定獲得10個糖鏈結(jié)構(gòu)（A2，F(xiàn)A2，A2FG，A3，F(xiàn)A3，A3FG，A4，F(xiàn)A4，A4FG和A3F2G2）以及糖肽YLGnATAIFFLPDEGK的Asn271位點(diǎn)上鑒定獲得5個糖鏈結(jié)構(gòu)（A2，F(xiàn)A2，A2FG，A3和A3FG）。我們相信該方法將廣泛用于在各種疾病發(fā)展期間對A1AT或其他關(guān)鍵糖蛋白上的核心-和天線-巖藻糖基化進(jìn)行鑒定和定量。

       補(bǔ)充信息

       圖S1糖肽1，糖肽2或糖肽3具有相同的最適低能量HCD CE24。

       圖S2所有鑒定的具有不同糖基修飾類型糖肽：糖肽1（含有Asn107位點(diǎn)），糖肽2（含有Asn271位點(diǎn)）和糖肽3（含有Asn70位點(diǎn)）的低能量HCD MS2，高能量HCD MS3和CID MS2圖譜。

       圖S3唾液酸酶/半乳糖苷酶消化的A1AT樣品，唾液酸酶/半乳糖苷酶/α 1-2,3,4,6巖藻糖苷酶消化的A1AT樣品以及唾液酸酶/半乳糖苷酶/α 1-3,4巖藻糖苷酶消化的A1AT樣品中的巖藻糖基化糖肽的XIC（提取離子流圖）圖譜。

       表1.雙重消化后的A1AT糖肽以及每個位點(diǎn)的核心-和天線-巖藻糖基化的相對峰面積的總結(jié)。

       表2.卡方檢驗(yàn)用于比較從A1AT蛋白質(zhì)釋放的糖鏈類型（數(shù)據(jù)來源于以前的結(jié)果[19]）和糖肽1（含有Asn107位點(diǎn)）的糖鏈修飾類型或糖肽2（含有Asn271位點(diǎn)）的糖鏈修飾類型（表2）之間的主要糖鏈修飾類型的相對峰強(qiáng)度。

       * p值< 0.05 認(rèn)為差異顯著

       圖1 鑒定A1AT糖基化的實(shí)驗(yàn)工作流程。首先將糖基化的A1AT酶切成肽段，然后通過唾液酸酶/半乳糖苷酶雙重消化進(jìn)行糖基的切除。將糖肽進(jìn)行直接LC-MS/MS分析而不需要釋放糖鏈。

       圖2在不同的離子傳輸管溫度，噴霧電壓和RF％設(shè)定條件下，具有A2和FA2糖基修飾類型的A1AT糖肽（Asn271）的源內(nèi)裂解。

       圖3具有A2FG糖基修飾類型的A1AT糖肽（Asn271）的圖譜：（A）低能量HCD MS2圖譜；（B）低能量HCD誘導(dǎo)的高能量HCD MS3圖譜；（C）低能量HCD誘導(dǎo)的CID MS2；（D）糖肽裂解的示意圖。

       圖4 各種低能量HCD碰撞能量下具有A2，F(xiàn)A2和A2FG糖基修飾類型糖肽（Asn 271）的MS2裂解模式，表明CE24下的低能量HCD產(chǎn)生信號最強(qiáng)的Y1離子（肽+GlcNAc）。

       圖5 各種高能量HCD碰撞能量下糖肽（Asn271）Y1離子（肽+GlcNAc）的MS3裂解模式，表明在CE35下的高能量HCD提供了的裂解圖譜。

       圖6 在各種CID碰撞能量下具有A2，F(xiàn)A2和A2FG糖基修飾類型的糖肽（Asn271）的MS2裂解模式，表明在CE30或CE35下這些糖肽獲得了相似的裂解圖譜。

       圖7 通過唾液酸酶/半乳糖苷酶消化來區(qū)分糖肽（Asn271）的核心-和天線-巖藻糖基化（A：保留時間；A.1：FA2的圖譜；A.2：A2FG的圖譜）。作為對照，唾液酸酶消化的情況下沒有觀察到差異（B：保留時間；B.1：A2G2（F）的圖譜）。

       圖8 在3D結(jié)構(gòu)中A1AT的三個糖基化位點(diǎn)Asn70，Asn107和Asn271標(biāo)記為紅色，通過質(zhì)譜檢測到的肽段標(biāo)記為綠色。

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