工藝設(shè)備中生物膜的形成會導(dǎo)致后續(xù)GMP生產(chǎn)中的一系列問題。工藝設(shè)備表面由革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、霉菌和細菌孢子等組成的生物膜會影響到使用此設(shè)備生產(chǎn)的產(chǎn)品的安全性、成分、規(guī)格、質(zhì)量和純度，并可能進一步導(dǎo)致產(chǎn)品污染、危害消費者從而受到法規(guī)懲罰。

       FDA關(guān)于微生物污染的法規(guī)如下：

       對于非無菌藥品生產(chǎn)，需要設(shè)立并遵守適當?shù)臅娌僮髁鞒桃灶A(yù)防有害微生物污染。

       對于無菌藥品生產(chǎn)，需要設(shè)立并遵守適當?shù)臅娌僮髁鞒桃灶A(yù)防有害微生物污染。此類操作流程需要包括所有無菌和滅菌工藝的驗證。

       如下文中的例子，產(chǎn)品的微生物污染通常會導(dǎo)致召回。

       這家公司聲稱其在2017年8月1日至2018年4月生產(chǎn)的產(chǎn)品中，有一"小部分"微生物污染檢測結(jié)果為陽性。2018年7月，這家公司宣布因為在FDA例行檢查中發(fā)現(xiàn)有布氏假單胞菌、熒光假單胞菌和多噬伯克霍爾德氏菌污染召回4個批次的產(chǎn)品。

       FDA法規(guī)和上述產(chǎn)品召回的案例證明微生物污染對于藥品生產(chǎn)者和監(jiān)管者而言都是明確的關(guān)注點。任何在生產(chǎn)現(xiàn)場發(fā)生的微生物污染問題都需要用適當和徹底的調(diào)查以及強有力的糾正和預(yù)防措施來處理。

       本文將會闡述生物膜的生命周期、可能會引起生物膜形成的條件或因素以及生物膜問題處理的方法。這些內(nèi)容可以幫助藥品生產(chǎn)者前攝性地采取適當?shù)牟僮髁鞒桃员M可能減少生物膜污染的風(fēng)險。

       生物膜的生命周期

       微生物一般是浮游性的，例如在培養(yǎng)基中根據(jù)代謝和生產(chǎn)特性處于未貼壁或自由懸浮狀態(tài)。最近的研究發(fā)現(xiàn)微生物也可以在材料表面附著、生長，形成復(fù)雜的微生物群落。這一現(xiàn)象引發(fā)了后續(xù)關(guān)于表面附著微生物（生物膜）性質(zhì)的研究。

       生物膜到底是什么？一般認為，生物膜是由多種微生物組成的生物群落，其外包被有黏滑的、由多糖、核酸和蛋白組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的"胞外多聚物基質(zhì)"。

       以下是生物膜生命周期的三個主要階段：

       Diagram 1: Biofilm Lifecycle

       第一階段：附著

       自由浮動的或浮游的細菌細胞在潮濕環(huán)境下可以附著在材料表面并開始分泌被稱為胞外多聚物基質(zhì)（EPS）的黏滑、膠狀基質(zhì)。附著在表面的微生物可以是單一種屬，也可以由多種細菌、真菌、藻類、酵母、原生動物或其他微生物以及細胞碎片和腐蝕產(chǎn)物組成。

       第二階段：生長

       在胞外多聚物基質(zhì)的保護下，生物膜可以快速成長為具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的群落，視環(huán)境條件從若干層細胞到幾英寸厚不等。

       第三階段：脫落

       生物膜生長成熟后，大小不等的細胞團塊和碎片可以從其三維結(jié)構(gòu)上脫離，使得原群落中的細菌可以散播并附著到下游的其他表面或生物膜群落上。

       生物膜污染經(jīng)常反復(fù)發(fā)生。短時間內(nèi)污染問題可能表現(xiàn)為受控狀態(tài)。但是如果針對生物膜的去除和處理措施不夠有效，一段時間后仍然可能發(fā)現(xiàn)污染。

       形成生物膜的影響因素

       下文的表2列舉了一些工藝設(shè)備中可能會導(dǎo)致生物膜形成的因素。

       設(shè)備/工藝：管道中流速小于1.5 m/s會增加微生物附著在管道表面的可能性。死角是指工藝設(shè)備中一些液體容易潴留且不易和清洗劑和水充分交換的部位。長徑比（L/D）大于1.5的死角易形成潴留液體、積累殘留或微生物。非衛(wèi)生級閥門易積累殘留且不易清洗，通常建議使用衛(wèi)生級閥門如隔膜閥或夾管閥。管路的不適當坡度會影響排水能力，從而增加液體潴留在系統(tǒng)中的可能。通常建議的管路坡度為0.5% - 1%（每1米下降0.5到1厘米）以保證排水能力。

       表面粗糙度：通常用Ra，即輪廓算數(shù)平均偏差來衡量某一材料的表面粗糙度。不銹鋼表面的腐蝕會增加其表面粗糙度。在此情況下，其表面會更不容易清洗。因此常規(guī)的清洗操作流程有可能不能有效去除粗糙表面的殘留。而這些產(chǎn)品殘留會給生物膜的生長提供良好的條件。

       殘留：開發(fā)清洗工藝（包括使用合適的清洗試劑、時間、清洗劑濃度和溫度）時需要考慮的重要因素。開發(fā)出來的清潔工藝必須證明能夠持續(xù)有效地去除產(chǎn)品殘留。產(chǎn)品殘留除了會影響殺菌或滅菌工藝的有效性，同時也為微生物生長提供了營養(yǎng)源。

       Diagram 2: Factors leading to Biofilm Formation

       生物膜問題處理

       工藝設(shè)備中生物膜問題存在的最初信號之一是微生物檢測中頻繁發(fā)生微生物超標。胞外多聚物基質(zhì)（EPS）保護了生物膜中的微生物并增加了其對于殺菌和清洗工藝的抵抗能力。如果一家工廠遭遇了反復(fù)發(fā)生的微生物污染事件，其首要任務(wù)是確定和徹底清除微生物污染的來源。關(guān)于生物膜問題經(jīng)常問到的問題是："如何徹底清除生物膜？"

       一旦在系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)有可能的生物膜問題，需要采取生物膜處理措施以去除生物膜殘留并同時對整個設(shè)備進行滅菌。這類處理措施通?？梢苑譃槿?。

       使用堿性配方清洗劑以穿透EPS并使EPS失活。配方清洗劑中的表面活性劑能夠有效地穿透EPS并使EPS失活。去除EPS保護層對徹底清除生物膜非常重要。

       不銹鋼表面的腐蝕或紅銹經(jīng)常伴隨生物膜問題一同存在。在這種情況下，需要對腐蝕/銹蝕表面進行除銹和鈍化以修復(fù)不銹鋼表面的鈍化膜。如果沒有發(fā)現(xiàn)紅銹問題則可以省略這一步。

       使用殺孢子劑或高溫蒸汽對整個系統(tǒng)進行滅菌

       這一步通過使用殺孢子劑（例如過氧化氫/過乙酸混合物、異丙醇、乙醇或高溫蒸汽滅菌）徹底清除工藝系統(tǒng)中殘存的微生物。

       美國環(huán)保署（EPA）有兩種標準測試方法來評估消毒試劑對于兩種易形成生物膜的微生物（綠膿假單胞菌和金黃色葡萄球菌）的效力，并同時作為這些產(chǎn)品標簽聲明的法規(guī)指南。如果一家消毒產(chǎn)品供應(yīng)商希望在其廣譜消毒劑的標簽上添加硬質(zhì)無孔表面去除生物膜的聲明，這些測試方法和指南為其提供了一個框架。

       在生物膜問題處理策略中，通常推薦使用標簽上帶有生物膜去除聲明的廣譜消毒劑。

       預(yù)防性措施

       俗語有言："一份預(yù)防勝過十分治療"。通過以下措施前攝性地預(yù)防生物膜的形成是更好的策略。

       工藝設(shè)備的易清洗性。工藝設(shè)備的工程設(shè)計應(yīng)考慮到易于清洗，如衛(wèi)生級設(shè)計和配件。

       使用合適的清洗試劑和清洗參數(shù)有效地去除工藝設(shè)備上的殘留。

       使用酸性清洗劑定期進行不銹鋼設(shè)備的維護。

       優(yōu)化清洗/殺菌頻率以保持設(shè)備處于潔凈狀態(tài)。

       對于收集到的微生物數(shù)據(jù)進行例行的趨勢分析可以幫助管理者知曉工藝系統(tǒng)微生物控制的狀態(tài)以及對于不良趨勢可以采取早期介入。

       結(jié)論

       理解生物膜的生命周期、特性和處理方法十分重要。此外，制藥、生物制藥和醫(yī)療器械生產(chǎn)工藝中的生物負載控制取決于多種因素。這些因素包括有效的清洗工藝、良好的工程設(shè)計、定期的設(shè)備維護程序和持續(xù)性的檢測和趨勢分析。這些預(yù)防性的措施可以盡可能減少生產(chǎn)設(shè)施中的微生物污染風(fēng)險，確保任何生產(chǎn)出來的藥品對患者和消費者都是安全的。

       參考文獻

       1) Pharmaceutical Technology Editors (Aug 22, 2018), King Bio Recalls Products Due to Microbial Contamination (http://www.pharmtech.com/king-bio-recalls-products-due-microbial-contamination)

       2) Lopolito, P., and E. Rivera. "An Audit Approach to Address Microbial Contamination in Process Equipment." In Contamination Control in Healthcare Product Manufacturing, 2013, co-published by PDA and DHI

       3) Cleanroom Technology, Strategies for Biofilm Remediation, A. Deal, D. Klein and P. Lopolito Jul 2015.

       4) STERIS internal document, Tech Tip #3088 - General Cleaning Recommendation for Removal of Microbial Residue

       作者簡介：

       Richard Chai

       技術(shù)服務(wù)經(jīng)理

       史帝瑞生命科學(xué)

       Richard Chai先生（以下簡稱Richard）目前任職史帝瑞技術(shù)服務(wù)經(jīng)理，致力于為客戶提供潔凈室清潔和微生物污染水平控制相關(guān)的技術(shù)培訓(xùn)（包括消毒劑驗證、產(chǎn)品接觸表面的清潔和清潔驗證）。他同時還是ISPE會議的講師。

       加入史帝瑞之前，Richard有過13年在干粉吸入器、生物無菌灌裝和包裝、醫(yī)療器械和生物醫(yī)藥設(shè)備制造和驗證相關(guān)的工作經(jīng)驗，因此對潔凈室的清潔和消毒要求、微生物污染水平控制的方法有深入的理解。Richard曾擔任過驗證咨詢專家，對許多制藥客戶在設(shè)備驗證、產(chǎn)品接觸表面的清潔驗證、消毒劑驗證和產(chǎn)品接觸/非接觸表面的清潔等方面提供驗證技術(shù)支持。