第二部分：APOE基因變異，變了一個胺基酸，變了命運

       3.APOE基因型與相應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)和功能

       APOE基因有三種常見的變異型，分別是E2, E3和E4變異型，互相之間，僅有一個核苷酸的區(qū)別。E3型最常見，約占65-70%的比例，而E4型約占15-20%，E2型占約5-10%。E3型被認為是正常型，以E3型為參照，E4型顯著增加老年癡呆癥風(fēng)險，而E2型微小減弱風(fēng)險。我們先從分子生物學(xué)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的角度來看發(fā)生了什么？apoE蛋白分子上有兩個重要功能區(qū)域，受體結(jié)合區(qū)域(LDL receptor binding domain)和油脂結(jié)合區(qū)域(lipid binding domain)。受體結(jié)合區(qū)域位于蛋白質(zhì)中部，富含帶正電荷的堿性胺基酸，有利于與帶負電荷的細胞表面受體結(jié)合。油脂結(jié)合區(qū)域位于蛋白質(zhì)尾部（C-端）， 富含疏水胺基酸。APOE基因的E4和E2變異型表現(xiàn)為兩個位置上的胺基酸改變：E4變異使第130號位置從半胱胺酸Cys變?yōu)榫匪酇rg，而E2變異使第176號位置從精胺酸Arg變?yōu)榘腚装匪酑ys。也就是說正常的E3型蛋白質(zhì)apoE3是130Cys,176Arg；高風(fēng)險E4型蛋白質(zhì)apoE4是130Arg, 176Arg；而低風(fēng)險E2型蛋白質(zhì)apoE2是130Cys, 176Cy。這些胺基酸改變會造成什么樣的功能變化呢？

       第一，簡單的從胺基酸層面看，我們不難看出，apoE4在130號位置增加了一個正電荷胺基酸Arg，而apoE2在176號位置損失了一個正電荷胺基酸Arg。有趣的是，第130和176號位置分別位于apoE蛋白質(zhì)的受體結(jié)合區(qū)域的兩側(cè)。apoE受體結(jié)合核心區(qū)域位于152-168號位置，這個區(qū)域富含帶正電荷的堿性胺基酸，用于與富含負電荷胺基酸的受體結(jié)合。apoE2蛋白質(zhì)在靠近受體結(jié)合區(qū)域位置上失去了一個正電荷胺基酸。實驗證明apoE2與其在肝細胞上的受體LDLR的結(jié)合能力卻實大大下降，只有正常的apoE3的2%。而apoE4蛋白質(zhì)在距受體結(jié)合區(qū)域稍遠的位置上增加一個帶正電荷的胺基酸，apoE4其與受體的結(jié)合能力則比正常的apoE3微小增加。因此，如果用與受體的結(jié)合能力來評價功能改變，apoE3為正常型，apoE2為嚴重失活型，而apoE4為微弱增活型。在人群中我們則觀察到，攜帶有E2/E2純合子變異的人容易患一種稱為三型高血脂的疾病，此病的重要特癥是血液中乳糜微粒和其他脂蛋白殘體不能被肝細胞清除，所以也稱為殘體代謝病(remnant metabolic disorder)。更進一步的觀察還發(fā)現(xiàn)，APOE基因上其他幾個在受體結(jié)合區(qū)域失去帶正電荷基酸的變異，也都會導(dǎo)致家族性三型高血脂癥，進一步肯定了這一區(qū)域失去正電荷會系統(tǒng)性的損壞apoE與其受體的結(jié)合能力。apoE與受體的結(jié)合能力是apoE4>apoE3>>apoE2。僅從受體結(jié)合能力的角度，我們很難解釋為什么只微弱增加受體結(jié)合能力的E4變異會那么顯著的增加老年癡呆癥風(fēng)險，而受體結(jié)合能力損失了90%的E2變異確只微弱減輕風(fēng)險。因此我們推斷，apoE與受體結(jié)合的通道可能不是其主要的老年癡呆癥致病機制。

       第二，從蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的變化角度我們可以看到，E4變異會引起apoE4蛋白質(zhì)區(qū)域間出現(xiàn)新的鹽鍵。在130號位置引入一個帶正電荷的胺基酸Arg, 會導(dǎo)致一個特殊的新鹽鍵，這個鹽鍵恰好鎖住了apoE蛋白質(zhì)尾部的脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域，使這一區(qū)域喪失了靈動性，進而影響了這一區(qū)域與油脂分子的結(jié)合能力和選擇性。見示意圖。逐一置換APOE基因上胺基酸的實驗證明，僅有E4變異所在的位置才可能通過鹽鍵改變脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域的構(gòu)像。這暗示E4變異造成脂質(zhì)結(jié)合區(qū)構(gòu)象的改變是唯一的和特殊的，其它位置上的胺基酸變化幾乎沒有可能獲得類似的構(gòu)象變化。在現(xiàn)實生活中，確實沒有發(fā)APOE基因上的其他突變增加老年癡呆癥風(fēng)險。

       現(xiàn)在我們來看看因E4變異而鎖住尾部脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域可能導(dǎo)致什么樣的功能變化。實驗數(shù)據(jù)顯示，apoE4脂蛋白微粒的含脂量比正常的apoE3少2-3倍。而apoE2雖然與受體的結(jié)合能力大為下降，但其含脂量不受影響，與正常的apoE3相當(dāng)。除了含脂量的多少外，apoE4更喜歡與甘油三酯親和，而與膽固醇及磷脂的親和力下降。apoE2和apoE3能更好的與膽固醇和磷脂親和。從脂蛋白含脂量的角度來看看，apoE4<

       4.APOE與淀粉樣蛋白斑塊形成假說

       APOE是老年癡呆癥重中之重的風(fēng)險基因, 有很多假說試圖解釋APOE如何導(dǎo)致老年癡呆癥，這些假說復(fù)蓋了幾乎所有可能的病因通道。這里我們只作重討論APOE可能通過什么樣的機理導(dǎo)致粉狀蛋斑塊沉積。我們知道攜帶APOE基因E4變異的患者不但發(fā)病時間早，腦中的淀粉樣蛋白沉積更多，斑塊的密度也更高?？梢圆聹y影響大腦中淀粉樣蛋白斑塊形成的途徑主要有三個：過度產(chǎn)生，清除受阻，聚合加速。因為apoE是一個脂蛋白，并不直接參與淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，那么擾亂清除和加速聚合沉積可能是最主要的機制。我們先來看看正常生理狀態(tài)下大腦中淀粉樣蛋白是如何產(chǎn)生和清除的。

       淀粉樣蛋白的生理功能尚不清楚。淀粉樣蛋白主要由神經(jīng)細胞產(chǎn)生，神經(jīng)細胞中的淀粉樣蛋白前體APP經(jīng)由幾個酶的分步切割而產(chǎn)生一組長度為30-51個胺基酸的短肽并釋放到細胞外，這些短肽稱為淀粉樣蛋白β多肽(amyloid β peptide, or Aβ)。最常見的Aβ短肽有兩種，Aβ40和Aβ42。Aβ40含40個胺基酸，是神經(jīng)細胞正常情況下主要產(chǎn)生的一種，這種短肽的水溶性更好，不易發(fā)生自身聚合。Aβ42含42個胺基酸，比Aβ40在C-端多了兩個胺基酸，遠比Aβ40更容易發(fā)生聚合。分析老年癡呆癥病人腦中的斑塊發(fā)現(xiàn)，有的斑塊全部由Aβ42組成，有的斑塊則以Aβ42為主伴有少量的Aβ40。大多數(shù)Aβ短肽分子在細胞外間質(zhì)中的構(gòu)像是可溶性的球狀結(jié)構(gòu)，稱為可溶性Aβ。但在一定條件下，Aβ短肽，特別是Aβ42之間可以通過氫鍵反相聚合成形成有序的纖維狀寡聚體，再進一步聚合成β片層結(jié)構(gòu)(β-sheet)。這些非常有序的片層結(jié)構(gòu)聚合物會越聚越大，因為疏水基團暴露于其表面而難溶于水，結(jié)果在細胞外間質(zhì)中形成看起來像淀粉一樣的沉淀物，這些沉淀物堆聚而成的斑塊稱為淀粉樣蛋白斑塊(amyloid β plaques)。這里β是指通過β片層結(jié)構(gòu)形成的淀粉樣蛋白斑塊。詳見示意圖示。

       絕大部分可溶性Aβ是通過血腦屏障轉(zhuǎn)運到血液中而被清除的。在血腦屏障上表達的脂蛋受體LRP1 被認為是負責(zé)轉(zhuǎn)運可溶性Aβ進入外周血液的主要通道。小鼠同位素標(biāo)記灌注實驗顯示，LRP1轉(zhuǎn)運可溶性Aβ的速度非常快，并且轉(zhuǎn)運Aβ40的速度比是轉(zhuǎn)運Aβ42的速度快約兩倍。但是，如果有apoE同時存在，無論是高度脂質(zhì)化的apoE還是裸體apoE, 都會使可溶性Aβ的轉(zhuǎn)運速度大為下降。我們前面講過，LRP1也是apoE的受體，以上實驗結(jié)果似乎暗示，一旦apoE與LRP1結(jié)合，就會阻礙可溶性Aβ通過血腦屏障清除。我們前面講過，不同變異型apoE與受體的結(jié)合的能力是APOE4>APOE3>>APOE2，那么可以猜測，apoE與受體的結(jié)合能力越強，其阻礙可溶性Aβ通過LRP1通道清除出大腦的能力就越強，反之亦然。支持apoE阻礙可溶性Aβ清除的證據(jù)還來自小鼠基因剔出實驗(APOE knockout mouse)。在老年癡呆癥模型小鼠上剔除APOE基因，腦中的淀粉樣蛋白斑塊會顯著減小。除了LRP1通道外，另一個在血腦屏障上表達的脂蛋白受體LRP2 （LDL receptor related protein2) ，可以轉(zhuǎn)運與apoJ脂蛋白微粒結(jié)合的不溶性Aβ。LRP2基因及編碼apoJ的CLU基因都是老年癡呆癥風(fēng)險基因。除了通過血腦屏障清除A?外，還有一部份Aβ，特別是不溶性Aβ，可能是通過與apoE脂蛋白結(jié)合，然后通過與細胞表面的脂蛋白受體結(jié)合轉(zhuǎn)運進入細胞中，并在細胞內(nèi)的溶酶體中被降解掉。大腦中的星型膠質(zhì)細胞(astrocytes), 小膠質(zhì)細胞(microglia)和神經(jīng)細胞上都表達LDLR和LRP1, 可以與apoE結(jié)合。另外，小膠質(zhì)細胞作為大腦中的免疫細胞，還可以通過非特異性內(nèi)吞機制（phagocytosis)把淀粉樣蛋白斑塊內(nèi)吞到細胞中加以消化。與內(nèi)吞機制相關(guān)的基因ABCA7和TREM2基因也與老年癡呆癥風(fēng)險強相關(guān)。

       前面我們分析了E4變異對蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的改變。E4變異嚴重改變了蛋白質(zhì)尾部脂質(zhì)結(jié)合區(qū)域的靈活性，這一結(jié)構(gòu)變化使apoE4與極性的膽固醇分子和磷脂結(jié)合較差，導(dǎo)致apoE4脂蛋白微粒含脂量顯著下降。我們可以想象星型膠質(zhì)細胞合成apoE脂蛋白微粒并分泌到細胞外，與神經(jīng)細胞分泌到細胞外的Aβ短肽混合共處于細胞間質(zhì)，apoE脂蛋白上的油脂分子，特別是膽固醇，可能會與Aβ短肽上暴露于表面的疏水性胺基酸親合，從而打破Aβ短肽自身聚合的平衡點，影響淀粉樣蛋白的形成。就象結(jié)晶過程中當(dāng)溶液濃度達到臨界點時，還需要有晶種才能觸發(fā)結(jié)晶一樣。如果apoE脂蛋白上的膽固醇分子可以干擾Aβ聚合”晶核”形成，那么即便脂蛋白上微小變化就有可能顯著改變Aβ聚合最終產(chǎn)量。讓我們先回顧一下, apoE主要由星型膠質(zhì)細胞合成, 與同樣在星型膠質(zhì)細胞中合成的膽固醇和磷脂等油性分子一起形成HDL like脂蛋白微粒，并分泌到細胞外，其主要生理功能被認為是為神經(jīng)細胞運送膽固醇和磷脂，用于神經(jīng)細胞的維修和擴增。膽固醇和磷脂都是極性油脂，就像洗滌劑一樣，可以乳化融合含有疏水基團的分子。不難想象，apoE脂蛋白含脂量越高，乳化融合Aβ的容量越大，反之亦然。這樣，我們就可以解釋為什么apoE4因為含脂量低，兼融Aβ的容量小，從而化解Aβ聚合“晶核“形成的能力就差。因此，Aβ更易在攜帶E4變異人群的大腦中聚合成淀粉樣蛋白斑塊。實驗證據(jù)顯示，在飽和濃度的Aβ溶液中，加入脂質(zhì)化的apoE會大大推遲Aβ自身聚合反應(yīng)發(fā)生的時間。這里，apoE脂蛋白的作用是減慢聚合核的形成。更多實驗顯示，膽固醇分子而不是磷脂分子，可以有效阻礙胰 腺中一種叫做Amylin 的淀粉樣蛋白聚合。并且膽固醇分子的前體分子lanosterol可以有效溶解眼睛白內(nèi)障中不溶的蛋白質(zhì)。包括Aβ淀粉樣蛋白在內(nèi)，這幾種不溶性蛋白質(zhì)都是β片層結(jié)構(gòu)形成的聚合物。

       支持apoE含脂量假說的一個重要證據(jù)來自ABCA1基因。apoE的脂質(zhì)化程度主要受ABCA1基因調(diào)節(jié)。ABCA1是一種分子泵，其功能是將細胞中膽固醇導(dǎo)流到含有apoE或apoJ的HDL-like脂蛋白微粒上。激活A(yù)BCA1表達可以顯著增加apoE脂蛋白微粒的含脂量。ABCA1基因的表達受視黃酸受體(retinoid receptor X, RXR)調(diào)節(jié)。視黃酸是維生素A衍生物，化學(xué)合成的RXR拮抗劑以及活化的維生素A都能有效激活A(yù)BCA1基因表達。給老年癡呆癥模型老鼠喂食RXR激動劑的實驗發(fā)現(xiàn)，小鼠腦中淀粉樣蛋白斑塊會在喂食RXR拮抗劑幾小時后開始大量清除。并且，ABCA1趨動的淀粉樣蛋白清除依賴于APOE基因的表達，在APOE基因剔出的小鼠中不起作用。為什么這么有效的RXR激動劑不用來治療人的老年癡呆癥呢？可惜將RXR激動劑用于人體臨床實驗時，雖然也觀察到淀粉樣蛋白斑塊清除，但是該激動劑在很短的用藥時間里即造成病人血脂極度升高，不得終停止這項人體臨床試驗。其他幾個能活化ABCA1表達的激動劑藥物，在老年癡呆癥小鼠模型中也得到同樣的結(jié)果。ABCA1基因突變與老年癡呆癥密切相關(guān)，己經(jīng)發(fā)現(xiàn)這個基因的失活變異增加老年癡呆癥風(fēng)險2-3倍，而ABCA1上的增活變異則能降低風(fēng)險。

       除了以上APOE淀粉樣蛋白假說外，有不少實驗工作顯示，APOE基因E4變異增加大腦中負責(zé)免疫功能的膠質(zhì)小細胞的活性和炎癥反應(yīng)。另一些證據(jù)則指向，表達E4的神經(jīng)細胞會生產(chǎn)更多容易聚合的Aβ42。并且?guī)в蠩4的神經(jīng)細胞對淀粉樣蛋白堆積更敏感，更容發(fā)生細胞凋亡和壞死。有趣的是，如果攜帶E4變異的人在運動中發(fā)生腦震蕩或腦部受傷，他們會比攜帶正常E3型的人需要更長的時間才能恢復(fù)。

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