近年來，基因毒問題是藥物開發(fā)、乃至上市后藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容之一，甚至成為了行業(yè)內(nèi)的“閃點(diǎn)”、“燃點(diǎn)”！然而，大部分同行在聊及基因毒問題時(shí)，大都僅停留在警示結(jié)構(gòu)、1.5ug的概念，很少?gòu)乃幚矶纠淼慕嵌葋硭伎蓟蚨镜恼嬲齼?nèi)涵。故，整理此文，望共同進(jìn)步。

       一、什么是遺傳毒？

       遺傳**可分為DNA損傷、基因突變、染色體結(jié)構(gòu)改變和染色體數(shù)目改變四類。廣義的遺傳**，是指由遺傳毒物引起生物細(xì)胞基因組分子結(jié)構(gòu)特異改變而使遺傳信息發(fā)生變化的有害效應(yīng)；因此，通過DNA損傷產(chǎn)生突變以及基因組復(fù)制過程誤差率增高皆為遺傳**的表現(xiàn)。而狹義的遺傳**是指遺傳毒物對(duì)DNA(或染色體)的損傷作用。

       二、遺傳毒理學(xué)歷史

       1927年，遺傳毒理學(xué)起源于H.J.Muller的開創(chuàng)性工作，他的研究發(fā)現(xiàn)放射不僅能夠增高突變的頻率，而且誘發(fā)的突變型或表型與沒有放射時(shí)所觀察的完全一致。所以，誘發(fā)的突變反應(yīng)必須根據(jù)基礎(chǔ)突變來評(píng)價(jià)。

        1938年，Sax在Muller研究的基礎(chǔ)上，又研究發(fā)現(xiàn)X射線能夠誘發(fā)紫露草花粉顆粒中染色體結(jié)構(gòu)畸變。在完全缺乏有關(guān)DNA結(jié)構(gòu)和染色體組成的情況下，Sax和他的同事發(fā)現(xiàn)染色體內(nèi)或染色體間的交換需要在核內(nèi)至少有兩處大的損傷。另外發(fā)現(xiàn)，接觸X射線總劑量不變，但延長(zhǎng)接觸時(shí)間，或在幾小時(shí)內(nèi)分為兩部分接觸，產(chǎn)生染色體畸變的量降低。

       1946年，Auerbach和他的同事們報(bào)道了氮芥能誘發(fā)果蠅突變，這些突變與X線誘發(fā)的突變表型是相同的，由此人們開始考慮化學(xué)物質(zhì)對(duì)遺傳的作用。

       到了20世紀(jì)70年代，有兩個(gè)事件使得能用誘變性資料來評(píng)價(jià)危險(xiǎn)度。Miller和他的同事們研究發(fā)現(xiàn)化學(xué)致癌物能在體外和體內(nèi)與DNA、RNA及蛋白質(zhì)作用形成穩(wěn)定的共價(jià)衍生物。

       同一時(shí)期，第二次發(fā)展改變了遺傳毒理學(xué)領(lǐng)域，那就是Ames（1975）和他的同事們所建立的用傷寒沙門菌進(jìn)行一種簡(jiǎn)單、廉價(jià)的突變?cè)囼?yàn)；該實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)化學(xué)物所致的組氨酸基因座的回復(fù)突變，并能結(jié)合使用一種外援性S9代謝系統(tǒng)。

       Ames試驗(yàn)于今天已被廣泛使用，而進(jìn)一步同為20世紀(jì)70年代的體內(nèi)微核試驗(yàn)，經(jīng)過幾十年的發(fā)展和應(yīng)用，目前已出現(xiàn)使用圖像分析、流式細(xì)胞儀和激光掃描細(xì)胞儀等多種自動(dòng)化系統(tǒng)檢測(cè)微核的方法。

       再之后，1994年Gatehouse等在Mutation Research上發(fā)表了國(guó)際遺傳**試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化研討會(huì)上制定的開展Ames試驗(yàn)的一系列建議；且OECD于1997年制定了Ames試驗(yàn)的指導(dǎo)原則，又進(jìn)一步促進(jìn)了該方法的標(biāo)準(zhǔn)化和應(yīng)用。

       而今，ICH、OECD等機(jī)構(gòu)已制定并頒布多個(gè)指導(dǎo)原則，用于遺傳毒理學(xué)的研究，并在不斷的持續(xù)更新...

       三、我國(guó)國(guó)內(nèi)發(fā)布的指導(dǎo)原則

       我國(guó)于2007年10月23日發(fā)布了《藥物遺傳**研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。在該指導(dǎo)原則起草過程和審評(píng)過程中一直強(qiáng)調(diào)： 指導(dǎo)原則只是原則性指導(dǎo)，且僅能反映當(dāng)時(shí)的認(rèn)識(shí)！ 研究者不能機(jī)械地照搬指導(dǎo)原則，而是應(yīng)充分發(fā)揮主觀能動(dòng)性，積極跟蹤學(xué)科進(jìn)展，推動(dòng)研究工作。

       2018年3月，為指導(dǎo)和規(guī)范藥物遺傳**研究，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局組織修訂了《藥物遺傳**研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，且同時(shí)宣布原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局2007年發(fā)布的《藥物遺傳**研究技術(shù)指導(dǎo)原則》廢止。

        我國(guó)最近發(fā)布的指導(dǎo)原則

        標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合

       指導(dǎo)原則指出：根據(jù)試驗(yàn)檢測(cè)的遺傳終點(diǎn)，可將檢測(cè)方法分為三大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據(jù)試驗(yàn)系統(tǒng)，可分為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合應(yīng)反映不同遺傳終點(diǎn)，包括體內(nèi)和體外試驗(yàn)，應(yīng)包含以下內(nèi)容：1）應(yīng)包含細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（又稱Ames試驗(yàn)），該試驗(yàn)已證明能檢出相關(guān)的遺傳學(xué)改變和大部分嚙齒類動(dòng)物和人類的遺傳**致癌劑；2）應(yīng)包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外和/或體內(nèi)試驗(yàn)。

       表1： 國(guó)內(nèi)指導(dǎo)原則標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合

       四、ICH頒布的指導(dǎo)原則

       1995年和1997年ICH分別頒布遺傳**指導(dǎo)原則S2A（藥物遺傳**試驗(yàn)的特殊性指導(dǎo)原則）、S2B（遺傳**：藥物遺傳**試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)組合）；ICH遺傳**指導(dǎo)委員會(huì)于2006年6月啟動(dòng)了遺傳**指導(dǎo)原則的修訂工作，并多次在美國(guó)、歐盟和日本等地召開會(huì)議商討修訂工作，最終于2011年11月正式修訂完成，完成ICH第四進(jìn)程，推薦給ICH管理三方(歐盟、美國(guó)、日本)采納使用。

       標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合

       指導(dǎo)原則指出：選擇一具有更多的歷史應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，部分原因是由于該組合被S2A和S2B指導(dǎo)原則推薦。然而，認(rèn)為選擇一和選擇二同等適合的原因如下：當(dāng)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，兩個(gè)實(shí)施良好的體內(nèi)試驗(yàn)（采用合適的組織和顯示有充分的暴露）的明確陰性結(jié)果，被認(rèn)為足以證明缺乏體內(nèi)遺傳**潛在性，因此進(jìn)行兩種體內(nèi)試驗(yàn)的試驗(yàn)策略，與對(duì)體外試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行追加試驗(yàn)是相同策略。

       表2：ICH S2（R1）指導(dǎo)原則標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合

       五、歷史上發(fā)生的藥品基因毒代表性事件

       2007年6月，羅氏制藥在歐洲市場(chǎng)推出的HIV蛋白酶抑制甲磺酸奈非那韋，因?yàn)樵谄洚a(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)一種經(jīng)典的基因**雜質(zhì)~甲基磺酸乙酯超標(biāo)，EMA暫停了它在歐洲的所有市場(chǎng)銷售。甲磺酸乙酯的引入是由于在生產(chǎn)設(shè)備清洗時(shí)，乙醇未被完全烘干而殘留下來，與甲磺酸奈非那非原料藥中的甲基磺酸反應(yīng)形成甲基磺酸乙酯。

     羅氏在被要求徹底解決污染問題后，還需要補(bǔ)充**研究數(shù)據(jù)，以更好的評(píng)估甲磺酸奈非那非的基因毒雜質(zhì)對(duì)患者的風(fēng)險(xiǎn)。直到羅氏公司完全解決了這些問題后，EMA才恢復(fù)了甲磺酸奈非那非在歐洲市場(chǎng)的相關(guān)授權(quán)。在這次甲磺酸奈非那非事件發(fā)生之后，世界各國(guó)的藥品管理機(jī)構(gòu)均針對(duì)基因**雜質(zhì)提出了更加明確的規(guī)定和要求，因此，國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥企業(yè)在新藥的研發(fā)過程中也越來越重視基因毒雜質(zhì)的控制和檢測(cè)。

       六、小分子藥物中常見的基因毒（雜質(zhì)）問題

       那么，如何認(rèn)識(shí)和控制基因毒雜質(zhì)呢？

       基因毒雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)多種多樣，對(duì)于絕大多數(shù)的雜質(zhì)而言，往往沒有充分的**或致癌研究數(shù)據(jù)，因而難以對(duì)其進(jìn)行歸類。在缺乏安全性數(shù)據(jù)支持的情況下，大多數(shù)法規(guī)和指導(dǎo)原則采用“警示結(jié)構(gòu)”作為區(qū)分普通雜質(zhì)和基因**雜質(zhì)的標(biāo)志。對(duì)于含有警示結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行（Q）SAR預(yù)測(cè)和體內(nèi)外遺傳**和致癌性研究，或者將雜質(zhì)水平控制在毒理學(xué)關(guān)注閾（TTC）之下。

       關(guān)于基因雜質(zhì)警示結(jié)果的具體詳細(xì)信息可參考?xì)W盟發(fā)布的警示結(jié)構(gòu)《Development of structural alerts for the in vivo micro nucleus assay inrodents》，或進(jìn)入The Carcinogenic Potency Database(CPDB)，里面有上千種致癌物質(zhì)的列表、結(jié)構(gòu)式、CAS號(hào)，作用部位，TTC值等一系列信息。

       ICH最早給出了的化學(xué)原料藥雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則Q3A（R2）、制劑雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則Q3B（R2），在這些指導(dǎo)原則中首次提到“對(duì)于能夠產(chǎn)生強(qiáng)的藥理活性或**的潛在雜質(zhì)，即使其含量低于0.1%，也必須進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定”。在之后修訂的版本中，進(jìn)一步明確“要關(guān)注原料藥中的潛在遺傳**雜質(zhì)”，以及“對(duì)于**非常強(qiáng)的基因**雜質(zhì)，需要根據(jù)實(shí)際情況來制定更低的檢測(cè)限度”，但也并未針對(duì)遺傳**雜質(zhì)及其研究和控制問題提出明確的闡述，同時(shí)，對(duì)其研究原則、限度要求及控制策略均沒有具體的要求。

       EMEA人用藥品委員會(huì)(CHMP)推出《遺傳**雜質(zhì)限度指導(dǎo)原則》，引入了可接受風(fēng)險(xiǎn)的攝入量，即毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）這個(gè)概念。設(shè)置了限度值TTC(1.5 μg/day)，即相當(dāng)于每人每天攝入1.5 μg的基因**雜質(zhì)，被認(rèn)為對(duì)于大多數(shù)藥品來說是可以接受的風(fēng)險(xiǎn)（一生中致癌的風(fēng)險(xiǎn)小于十萬分之一）。根據(jù)此閾值，按照每日預(yù)期的攝入量去計(jì)算出該活性藥物中能夠接受的雜質(zhì)水平。值得注意的是，TTC只是一個(gè)概率的方法，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。如果存在一個(gè)基因**雜質(zhì)，對(duì)其**未知，假設(shè)其每日的攝入量在TTC范圍內(nèi)，那它致癌的概率將會(huì)在10-5以下，因此限度值（TTC）不等于完全沒有風(fēng)險(xiǎn)。PS：針對(duì)不同類型的藥物，也有不同的閾值及算法。

       表3： 藥品中的基因毒雜質(zhì)分類

       七、M7指導(dǎo)原則~非常重要！

       M7于2014年6月由 ICH 指導(dǎo)委員會(huì)在ICH進(jìn)程的第4階段中予以通過；在ICH 進(jìn)程的第4階段，最后的草案被推薦給歐盟、日本和美國(guó)的監(jiān)管機(jī)構(gòu)采納。

       M7旨在提供一個(gè)可用于致突變雜質(zhì)的鑒別、分類、界定和控制的可行性框架，以限制潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，意在補(bǔ)充 ICH Q3A(R2)、Q3B(R2)和M3(R2)支持藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)和上市的非臨床安全性研究。PS：M7不適用于ICH S9范圍定義的用于晚期癌癥適應(yīng)癥的原料藥和制劑。

       M7再次給出了TTC、TD50、1.5μg/天等概念和數(shù)據(jù)，同時(shí)重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了上市后藥品變更后的基因毒雜質(zhì)問題；見下表。

       表4： 上市后藥品變更所要面對(duì)的基因毒雜質(zhì)問題

       八、結(jié)語(yǔ)

       基因毒問題，最為根本的還是安全性問題，而一個(gè)物質(zhì)是否安全、是否存在基因毒，要靠試驗(yàn)和數(shù)據(jù)來證明。至今，我們已經(jīng)知曉了很多基因毒物質(zhì)、也知道了怎么判斷警示結(jié)構(gòu)，但依然出現(xiàn)了NDMA事件！且不論事出原因如何，結(jié)果都是藥品的質(zhì)量出問題了！不過，當(dāng)質(zhì)量出現(xiàn)問題之時(shí)，作為一個(gè)藥品從業(yè)人員，反思更多的應(yīng)該是問題出在了哪里？到底我們應(yīng)該如何做出“安全、有效、質(zhì)量可控”的藥物！