隨著生物制藥行業(yè)的快速發(fā)展及競爭加劇，縮短藥品開發(fā)周期，開發(fā)高效、穩(wěn)健和高質(zhì)量的生產(chǎn)工藝并降低生產(chǎn)成本顯得尤為迫切。目前大部分企業(yè)使用高通量技術(shù)、平臺工藝以及一次性生產(chǎn)技術(shù)等來加速產(chǎn)品開發(fā)。其中高通量技術(shù)可同時開展多組實驗進行實驗設計(DOE)，可縮短工藝開發(fā)時間且能夠得到較好的實驗效果。高通量微型反應器的種類繁多，早期的產(chǎn)品如微孔板、24深孔板，其體積量在微升級別，多用于原始克隆篩選，但是因無法對細胞培養(yǎng)過程中重要參數(shù)監(jiān)控，導致使用范圍受限，并逐漸被淘汰。目前應用廣泛的3種高通量微型生物反應器分別是 Simcell、Ambr 15、Ambr 250，其培養(yǎng)體積規(guī)模各不相同，適用于不同的細胞培養(yǎng)工藝開發(fā)階段。

       SimCell微型反應器系統(tǒng)包括5個培養(yǎng)室，每個培養(yǎng)室含有42個卡式微型反應器模塊，每個模塊有6個總體積<800μL獨立控制的微型反應器(培養(yǎng)體積為300-700 μL) ，一臺SimCell系統(tǒng)理論上最多可同時運行1260個微型反應器。每個培養(yǎng)室可獨立控制溫度、相對濕度及通氣量，可在線測量細胞密度、pH及溶氧（DO）等參數(shù)。SimCell微型反應器可用于克隆篩選及早期工藝優(yōu)化。SimCell系統(tǒng)的顯著優(yōu)勢為超高通量和超微體積，但小體積無法滿足常規(guī)離線分析需求，且無攪拌槳，不能很好地擬合大規(guī)模反應器。

       Ambr 系統(tǒng)由一次性反應器罐體、自動化工作站及操作軟件3部分組成，包括Ambr 15 和 Ambr 250。Ambr 系統(tǒng)具有高通量、自動化及體積小等優(yōu)勢，且罐體幾何學設計如高徑比、槳葉設計等均與經(jīng)典攪拌反應器類似，可實時監(jiān)測和控制工藝過程中的各個參數(shù)，具有良好的平行性與放大性。Ambr 系統(tǒng)軟件具備較高效的數(shù)據(jù)記錄、管理和分析能力，可以在工藝開發(fā)和晚期臨床階段執(zhí)行 DOE 和數(shù)據(jù)分析。目前 Ambr 系統(tǒng)在生物制藥行業(yè)中得到了較為廣泛的應用。Ambr 15工作體積為10～15mL，一次可運行24～48個生物反應器，具有攪拌槳和獨立通氣管路。除溫度和轉(zhuǎn)速由工作站統(tǒng)一控制外，其他參數(shù)如pH 及 DO 均可獨立控制?；诟叨茸詣踊臋C械臂，Ambr 15 系統(tǒng)可自動完成取樣及補液操作。由于Ambr 15 系統(tǒng)培養(yǎng)體積較小，限制了培養(yǎng)過程中的取樣頻率和收獲體積，無法為下游純化及制劑分析提供足夠多的樣品。此外，細胞培養(yǎng)過程中取樣、補料及補堿等操作可能會引起Ambr 15系統(tǒng)在線 DO、pH及溫度的波動。

       Ambr250是Ambr 15 的升級產(chǎn)品，能獨立運行12～24個一次性生物反應器，工作體積為100-250mL，可滿足后續(xù)純化和樣品分析需求，可獨立控制溫度和轉(zhuǎn)速，有4條補料管路連接每個反應器，可實現(xiàn)分批補料(10μL～10mL) 或連續(xù)流加，實現(xiàn)細胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵不同工藝的需求。Ambr 250一次性反應器含有雙層斜三葉槳，嵌合4個擋板以促進液體混合，與傳統(tǒng)生物反應器有類似的幾何尺寸及流體力學性質(zhì)，從而保證 Ambr 250細胞培養(yǎng)的微環(huán)境在一定程度上與傳統(tǒng)反應器更接近，工藝容易放大。

       近年來，高通量微型生物反應器已在生物制藥行業(yè)得到廣泛應用，可應用于細胞株篩選、培養(yǎng)基與工藝開發(fā)及工藝表征等各個階段。

       1、克隆篩選與培養(yǎng)基開發(fā)

       細胞株篩選要先把目的基因整合到基因組中，而這個過程是隨機的，因此，轉(zhuǎn)染后的每個細胞表現(xiàn)各異，需進行大量克隆篩選以得到最終的高產(chǎn)穩(wěn)定細胞株。一般使用微孔板等進行早期高通量克隆篩選，然后在24深孔板、搖管或搖瓶中補料分批培養(yǎng)進行進一步篩選。從24深孔板、搖管或搖瓶中篩選得到的表現(xiàn)較好的細胞株在放大至反應器時會出現(xiàn)不一致情況，這是由于部分高表達克隆不具備可放大性，另外這些培養(yǎng)容器不能監(jiān)控pH 與 DO 等關鍵參數(shù)，培養(yǎng)微環(huán)境與臺式反應器相差甚遠，不能很好地預測高產(chǎn)克隆在反應器規(guī)模上的表現(xiàn)。傳統(tǒng)反應器由于通量低且運行成本高，評估的克隆數(shù)量有限，也不是理想的克隆篩選工具。為降低細胞株在工藝放大時出現(xiàn)異常風險，可使用高通量 Ambr 系統(tǒng)進行篩選評估，其具有較好的預測性和可放大性，是高效可靠的克隆篩選工具。此外，可通過整合的克隆篩選軟件進行克隆篩選排序評分，為候選克隆的選擇提供指導。此外，培養(yǎng)基開發(fā)是提高產(chǎn)量、質(zhì)量及降低生產(chǎn)成本的關鍵手段之一。高通量細胞培養(yǎng)設備可用于培養(yǎng)基的高通量快速篩選，優(yōu)化培養(yǎng)基的關鍵組分。

       2、工藝開發(fā)

       使用Ambr 15 反應器同步運行24個實驗條件考察接種密度、pH及 DO 等3個關鍵工藝參數(shù)，結(jié)果顯示相同條件下的反應器在細胞生長、代謝以及蛋白表達方面表現(xiàn)具有高度一致性，不同條件下的反應器則有明顯區(qū)別，大大提高了工藝優(yōu)化的效率。分別在搖瓶和Ambr 15 反應器中測試一種新開發(fā)的培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ambr 15 反應器中的細胞活率和蛋白產(chǎn)量相比于搖瓶均有明顯下降。經(jīng)過分析，Ambr 15反應器中蛋白產(chǎn)量和細胞活率的下降可能是由于乳酸濃度增加引起的。為了研究Ambr 15 反應器中乳酸濃度升高的原因，考察了轉(zhuǎn)速、通氣和pH 對乳酸積累的影響。結(jié)果顯示，通氣和pH 控制策略對乳酸積累有統(tǒng)計學意義上的影響，其中pH 影響顯著。使用優(yōu)化后的條件在Ambr 15 中運行，達到了與搖瓶培養(yǎng)一致的細胞活率和表達水平。高通量微型生物反應器中進行的工藝優(yōu)化需放大至生產(chǎn)規(guī)模反應器中，因此評價設備和工藝的可放大性也尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，將在Ambr 15 中開發(fā)的細胞培養(yǎng)工藝分別放大至2L反應器和80L，400L Zeta 不銹鋼生物反應器，結(jié)果顯示 Ambr15 與不同規(guī)模的反應器在細胞生長、代謝、蛋白表達及產(chǎn)品質(zhì)量屬性上均比較一致。這一結(jié)果顯示Ambr 15 反應器具備較好的可放大性。

       3、工藝表征

       細胞培養(yǎng)工藝表征的目的是研究關鍵操作參數(shù)與細胞培養(yǎng)關鍵性能指標如細胞生長、產(chǎn)品表達及最終產(chǎn)品關鍵質(zhì)量屬性等之間的關系，來確定各關鍵操作參數(shù)的可接受范圍，并證明工藝的穩(wěn)健性。傳統(tǒng)上，一般使用1~10L規(guī)模的臺式反應器進行大量的 DOE 實驗以評估各個參數(shù)的主效應及交互作用影響，這需要投入大量的時間、人力和資源。高通量 Ambr 系統(tǒng)作為縮小模型進行工藝開發(fā)和工藝表征已有不少研究。

       Ambr 系統(tǒng)可作為高效的縮小模型應用于工藝開發(fā)與工藝表征，能顯著加快工藝開發(fā)和工藝表征過程。不過 Ambr 系統(tǒng)作為商業(yè)化生產(chǎn)工藝的縮小模型來進行工藝表征仍面臨一些挑戰(zhàn)。首先，縮小模型標準在 Ambr 和大規(guī)模生物反應器間是不可比的，需要對 Ambr 系統(tǒng)進行更詳細更有針對性的表征研究，并采用新的縮小模型策略。其次，需要采用更合適的風險評估及統(tǒng)計分析軟件來解決高通量實驗設計及數(shù)據(jù)分析的瓶頸。最后，需要認識到并非所有的工藝都可利用 Ambr 系統(tǒng)建立縮小模型，要充分了解設備的限制以及相關的關鍵操作參數(shù)及關鍵質(zhì)量屬性。

       高通量微型生物反應器系統(tǒng)在早期工藝開發(fā)階段可使用 DOE 實驗進行高通量工藝研究，縮短工藝開發(fā)時間并降低人力物力成本，加速晚期臨床階段工藝優(yōu)化與工藝表征，推進生物藥物的快速發(fā)展。高通量微型反應器具有操作簡單、通量高、成本縮減等優(yōu)勢，能夠較大程度提升工藝開發(fā)的效率，降低研發(fā)成本和縮短研發(fā)周期。同時，這類反應器可有效結(jié)合DOE 設計進行工藝開發(fā)，提高工藝穩(wěn)定性和工藝質(zhì)量可控性，這也使得高通量微型反應器的應用前景更為廣闊。

       參考文獻：

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       [2]郭玉蕾,唐亮,孫瑞強,李尤,陳依軍.高通量微型生物反應器的研究進展[J].中國生物工程雜志,2018,38(08):69-75.DOI:10.13523/j.cb.20180809.

       作者簡介：小泥沙，食品科技工作者，食品科學碩士，現(xiàn)就職于國內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營養(yǎng)食品的開發(fā)與研究。