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       β-catenin、BCL9通路

       與蛋白結(jié)構(gòu)

       自1982年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)WNT1（最初命名為Int-1）基因以來(lái)，Wnt信號(hào)通路一直是開(kāi)發(fā)新癌癥療法中一個(gè)令人興奮的話題。目前，Wnt信號(hào)通路分為經(jīng)典Wnt（Wnt/β-catenin）信號(hào)通路和兩個(gè)非經(jīng)典Wnt（Wnt/Ca2+和Wnt/PCP）信號(hào)通路。

       研究最多的途徑是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路（通過(guò)β-Catenin激活基因轉(zhuǎn)錄），其協(xié)調(diào)健康胚胎中的組織更新和干細(xì)胞增殖、遷移、分化、存活發(fā)育和成人組織穩(wěn)態(tài)。Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)的異常激活與許多人類疾病密切相關(guān)，因?yàn)樗鼌⑴c止血功能。

       β-catenin充當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中的分子效應(yīng)子。然而，當(dāng)定位到質(zhì)膜時(shí)，β-catenin則充當(dāng)E-鈣粘蛋白和細(xì)胞骨架相關(guān)肌動(dòng)蛋白之間的橋梁，在細(xì)胞之間形成貼壁連接。

       在沒(méi)有細(xì)胞外Wnt配體的情況下（圖1A），β-catenin破壞了由軸抑制蛋白（Axin），腫瘤抑制性腺瘤性大腸息肉?。ˋPC），酪蛋白激酶1α（CK1α），糖原合酶激酶-3β（GSK-3β），E3泛素連接酶β-TrCP和凌亂蛋白（DVL）形成的復(fù)合物。在該復(fù)合物中，β-catenin的N端結(jié)構(gòu)域S33，S45，S37和T41被CK1α和GSK-3β磷酸化。磷酸化后的β-catenin被β-TrCP泛素化，從而促進(jìn)了β-catenin的蛋白酶體降解[1]。

       相反，在生理?xiàng)l件下（圖1B），細(xì)胞外Wnt配體與DVL和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合，激活DVL導(dǎo)致LRP6的磷酸化和Axin1的募集，從而抑制β-catenin的磷酸化和隨后的蛋白酶體降解。

       β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積聚并易位到細(xì)胞核以結(jié)合T細(xì)胞因子（TCF）或淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子（LEF）和幾種輔助因子，包括B細(xì)胞淋巴瘤 9 （BCL9）；cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）結(jié)合蛋白（CBP）；E1A 結(jié)合蛋白300 Da （p300） 和 Pygopus（Pygo 1或2），激活 Wnt 靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、存活、化療耐藥性和腫瘤免疫逃避。

       圖1. Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制

       在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Wnt/β-catenin通路通過(guò)一系列胞質(zhì)蛋白相互作用，使 β-catenin 蛋白在胞質(zhì)內(nèi)累積，進(jìn)而入核傳遞生長(zhǎng)刺激信號(hào)。該信號(hào)通路一旦出現(xiàn)異常就可能使細(xì)胞及生物體的功能產(chǎn)生一定程度的障礙或損壞，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體腫瘤的發(fā)生。目前，Wnt/β-catenin 通路已成為藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)的主要靶標(biāo)之一。

       人的β-catenin蛋白由781個(gè)氨基酸組成，包括N末端結(jié)構(gòu)域，C末端結(jié)構(gòu)域和包含12個(gè)armadillo重復(fù)序列（殘基141?664）的中央armadillo重復(fù)結(jié)構(gòu)域（ARD）。ARD 的N和C端結(jié)構(gòu)域在很大程度上是非結(jié)構(gòu)化的，并不像armadillo重復(fù)結(jié)構(gòu)域的那樣保守（圖2）。

       圖2. β-catenin的結(jié)構(gòu)

       據(jù)報(bào)道，大于20種β-catenin結(jié)合蛋白可以與β-catenin的armadillo重復(fù)結(jié)構(gòu)域（ARD）結(jié)合形成相互作用，并且已經(jīng)解析出β-catenin與一些結(jié)合蛋白（如人APC蛋白，人Axin蛋白，小鼠LEF1蛋白，非洲爪蟾TCF3蛋白，人ICAT蛋白，人TCF4蛋白，人BCL9蛋白以及Wnt信號(hào)相關(guān)蛋白鼠E-鈣粘蛋白和人LHR1蛋白）的晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)（圖3）。

       圖3. β-catenin及其相互作用伙伴

       值得注意的是，通過(guò)β-catenin及其核伙伴蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）轉(zhuǎn)錄激活靶基因，包括β-catenin/TCF、β-catenin/BCL9、β-catenin/CBP和β-catenin/p300，是Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)的最后一步途徑，表明破壞這些核復(fù)合物可能成為阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)異常激活的最有希望的策略。本文主要介紹破環(huán)β-catenin與BCL9蛋白蛋白相互作用的小分子抑制劑。

       人的BCL9蛋白由1394個(gè)氨基酸組成，可作為Wnt/β-catenin途徑的轉(zhuǎn)錄共激活劑。它有三個(gè)保守區(qū)域：Pygopus結(jié)合域HD1，β-catenin結(jié)合域HD2和典型的核定位信號(hào)肽HD3。

       β-catenin/BCL9復(fù)合物在腫瘤組織中占主導(dǎo)地位，但在健康細(xì)胞中不占主導(dǎo)地位。此外，抑制BCL9可以減少腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)，增強(qiáng)小鼠CRC模型中對(duì)抗PD-1治療的反應(yīng)。

       β-catenin/BCL9蛋白蛋白相互作用（PPI）接口掩埋了大約 1450 ?2，中等強(qiáng)度的 Kd約0.50 μM。β-catenin/BCL9 PPI 為由大約25個(gè)殘基螺旋段介導(dǎo)來(lái)自 BCL9的兩個(gè)熱點(diǎn)（圖 4）。熱點(diǎn)區(qū)域1包括β-catenin的D162、E163 和D164以及BCL9的H358和R359；熱點(diǎn)區(qū)域2包括β-catenin的A149、A152、L156、L159、L160、V167、A171、M174 和 L178和BCL9的L366、I369 和 L373。

       圖4. β-catenin /BCL9復(fù)合物的兩個(gè)主要熱點(diǎn)區(qū)域（PDB：2GL7）

       2

       β-catenin、BCL9的蛋白

       與蛋白相互作用小分子抑制劑

       β-catenin和核伙伴PPI的界面通常較大（約1450?3700 ?2）且平坦（通常暴露于溶劑），并且具有緊密的結(jié)合親和力（如β-catenin/TCF，具有Ki為7?10 nM），主要由疏水和帶電特性主導(dǎo)，這使得使用單個(gè)低分子量抑制劑難以阻斷 PPI。

       β-catenin/BCL9 PPI 界面要小得多（1450 ?2），并且該 PPI 顯示0.5 μM 的中等KD。β-catenin與BCL9相互作用的表面與其他β-catenin結(jié)合蛋白相互作用的表面幾乎沒(méi)有重疊，而E-鈣粘蛋白（區(qū)域V）是唯一已知的結(jié)合這種PPI的蛋白質(zhì)接口。

       盡管開(kāi)發(fā)β-catenin與BCL9的蛋白與蛋白相互作用抑制劑有挑戰(zhàn)，但是目前也有一些破壞它們相互作用的抑制劑被報(bào)道。

       2012年，Bienz等人通過(guò)ELISA篩選47,500種LOPAC/PhytoPure/MRCT化合物，發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物carnosic acid（1）為一種新型β-catenin/BCL9抑制劑。Carnosic acid特異性結(jié)合HD2-ARD，它的Ki為3.3 μM。核磁共振和晶體學(xué)分析揭示了carnosic acid在前四個(gè)ARD處直接結(jié)合β-catenin；與BCL9結(jié)合位點(diǎn)相鄰的固有不穩(wěn)定α螺旋在β-catenin是與carnosic acid相互作用所必需的（圖5）[2]。

       圖5. carnosic acid（1）的結(jié)構(gòu)與結(jié)合活性

       Ji等人使用ALPHAScreen選擇性測(cè)定法篩選207種天然產(chǎn)物/LOPACPfizer化合物，發(fā)現(xiàn)CP-868388（2），它的Ki為1.2 μM，并且它對(duì)β-catenin/BCL9的選擇性是 β-catenin/E-鈣粘蛋白的44倍，但不抑制反式活化在Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)（圖6）[3]

       圖6. CP-868388（2）的結(jié)構(gòu)與結(jié)合活性

       Ji等人基于CP-868388進(jìn)行進(jìn)一步藥物化學(xué)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)了β-catenin/ BCL9相互作用的新型小分子抑制劑CPPAA-30（4），它在AlphaScreen競(jìng)爭(zhēng)性抑制測(cè)定中以3.6 μM的Ki破壞β-catenin/ BCL9相互作用。

       基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)顯示，CPPAA-30選擇性地破壞了β-catenin/BCL9 PPI，同時(shí)沒(méi)有影響β-catenin/E-鈣粘蛋白PPI、劑量依賴性抑制Wnt信號(hào)反式激活、致癌 Wnt靶基因表達(dá)下調(diào)，以及靶向選擇性地抑制攜帶異常Wnt信號(hào)的癌細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖7）[4]。

       圖7. CPPAA-30（4）結(jié)構(gòu)和活性

       Ji等人繼續(xù)優(yōu)化這類結(jié)構(gòu)得到化合物ZW4864（5），在AlphaScreen測(cè)定中Ki 值為0.87 μM，與β-catenin結(jié)合并選擇性地破壞BCL9和β-catenin之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI），同時(shí)保留β-catenin/E-鈣粘蛋白PPI。ZW4864劑量依賴性抑制β-catenin信號(hào)激活，下調(diào)致癌β-catenin靶基因，并消除β-catenin依賴性癌細(xì)胞。更重要的是，ZW4864表現(xiàn)出色藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)并有效抑制患者來(lái)源的異種移植小鼠模型中的β-catenin靶基因表達(dá)（圖8）[5]。

       圖8. ZW4864（5）的結(jié)構(gòu)和活性

       Ji等人最近也報(bào)道了基于ZW4864進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到化合物6，它的Ki為2.7 μM。在細(xì)胞里β-catenin /BCL9 PPI的影響通過(guò)β-catenin/BCL9下拉抑制和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)反式激活的劑量抑制得到證實(shí)（圖9）[6]。

       圖9. 化合物6的結(jié)構(gòu)以及活性

       近期，Carrasco及其同事還使用HTS鑒定了一種有效的小分子抑制劑C-1（7），該抑制劑顯著減少了CRC細(xì)胞系的增殖并抑制了CRC異種移植小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)（圖10）[7]。

       圖10. 化合物7的結(jié)構(gòu)與活性

       Hoggard等人通過(guò)基于生物等排體的片段跳躍方案設(shè)計(jì)支架4'-氟-N-苯基-[1，1'-聯(lián)苯]-3-甲酰胺（化合物8），以模擬突出熱點(diǎn)的疏水側(cè)鏈的定位，同時(shí)考慮目標(biāo)蛋白熱點(diǎn)口袋的大小以及新生成的配體的生物相容性結(jié)構(gòu)。結(jié)合晶體結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)優(yōu)化，最后得到化合物PNPB-22（9），它可以抑制Wnt通路AXIN2, LGR5, LEF1, and cyclic D的mRNA表達(dá)，可以明顯抑制一些細(xì)胞如SW480, HCT116, HT29, MDA-MB-231, MDA-MB-436等增殖（圖11）[8]。

       圖11. PNPB-22（9）的結(jié)構(gòu)與活性

       Li等人發(fā)現(xiàn)一系列3-苯基哌啶衍生物抑制β-catenin/BCL9蛋白蛋白相互作用。其中，化合物10表現(xiàn)出最 好的抑制活性，在競(jìng)爭(zhēng)性熒光偏振測(cè)定中它的IC50為0.72 μM，對(duì)β-catenin的KD值為0.26 μM。該化合物選擇性抑制CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制Wnt信號(hào)反式激活和下調(diào)致癌Wnt靶標(biāo)基因表達(dá)（圖12）[9]。

       圖12. 化合物10的結(jié)構(gòu)與活性

       Zhang等人在EJMC上報(bào)道槲皮素衍生物作為新型β-catenin/BCL9蛋白相互作用抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和生物學(xué)評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)了化合物11，在FP assay它對(duì)β-catenin的IC50為2.78 μM，在SPR實(shí)驗(yàn)中它對(duì)β-catenin的Kd為1.23 μM。它直接與β-catenin結(jié)合，并在蛋白質(zhì)水平和細(xì)胞環(huán)境中破壞β-catenin/BCL9相互作用。

       C1還有效地抑制了體外結(jié)直腸癌，并在抑制CT26和HCT116等過(guò)度活躍的Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)細(xì)胞方面顯示出更好的選擇性。他們同時(shí)證實(shí)C1可以抑制CT26腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境（圖13）[10]。

       圖13. 化合物11的結(jié)構(gòu)與活性

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       小結(jié)

       理論上，直接破壞β-catenin與其核伙伴（包括TCF，BCL9，CBP和p300）的相互作用可以抑制過(guò)度活躍的Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，并提供上述獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

       然而，最近的研究表明，幾個(gè)報(bào)道的直接靶向β-catenin的抑制劑，包括carnosic acid（1)，PNU-74654，UU-T02，PNPB-22（9）和HI?B1，在ITC和DSF測(cè)定中與β-catenin ARD沒(méi)有體外結(jié)合。這可能表明這些化合物靶向β-catenin與BCL9結(jié)合的瞬時(shí)結(jié)合位點(diǎn)，這也強(qiáng)調(diào)了直接靶向β-catenin的困難。

       總的來(lái)說(shuō)，關(guān)于破壞β-catenin與其核伙伴相互作用的抑制劑開(kāi)發(fā)的研究仍處于起步階段，將這里介紹的抑制劑推向臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的路要走。這種批準(zhǔn)過(guò)程緩慢的背后有四個(gè)主要因素：（1）盡管已經(jīng)廣泛研究了高度進(jìn)化保守的Wnt/β-catenin信號(hào)通路40多年，但尚不清楚它是否可以成功被靶向，并具有可接受的安全性；（2）與傳統(tǒng)靶標(biāo)相比設(shè)計(jì)選擇性和有效的小分子抑制劑仍然有挑戰(zhàn)。β-catenin和核伙伴PPI的界面通常較大（約1450?3700 ?2）且平坦（通常暴露于溶劑），并且具有緊密的結(jié)合親和力（β-catenin/TCF，具有Ki 為 7?10 nM），主要由疏水和帶電特性主導(dǎo)，這使得使用單個(gè)低分子量抑制劑難以阻斷 PPI；（3）報(bào)告的小分子β-catenin/TCF和β-catenin/BCL9抑制劑的弱結(jié)合親和力（>100 nM）和基于細(xì)胞的活性限制他們的體內(nèi)評(píng)估。β-catenin/CBP抑制劑可以與參與許多轉(zhuǎn)錄過(guò)程的一般共激活劑CBP結(jié)合，這意味著它們不太可能是Wnt途徑特異性的；（4）一些已經(jīng)描述的小分子可能直接與β-catenin結(jié)合，但目前的結(jié)果無(wú)法證實(shí)Wnt抑制從β-catenin突變或耗盡的細(xì)胞中消失。由于這些原因，β-catenin的成藥性仍有待驗(yàn)證。

       許多相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)和科學(xué)的彎路指導(dǎo)開(kāi)發(fā)β-catenin及其核伙伴PPI的抑制劑，包括以下內(nèi)容：（1）在結(jié)構(gòu)優(yōu)化中應(yīng)考慮PK譜，（2）這些抑制劑應(yīng)在結(jié)合親和力和細(xì)胞活性保持平衡，以及（3）這些抑制劑應(yīng)治療多種β-連環(huán)蛋白相關(guān)適應(yīng)癥。

       破壞β-catenin與其核伙伴的相互作用具有巨大的影響挑戰(zhàn)，但該領(lǐng)域的研究應(yīng)繼續(xù)基于目前在這些方面的成就目標(biāo)，包括其高安全性和強(qiáng)效治療效果。隨著該領(lǐng)域的進(jìn)展，β-catenin相互作用仍然是癌癥治療中極具吸引力的靶標(biāo)。