隨著基因診斷技術和對疾病分子機制認識的發(fā)展，RNA療法正逐漸成為一種新的、非常有前途的治療方法，用于個性化和精準醫(yī)療，可治療罕見病和常見疾病。全球已上市寡核苷酸藥物見表1,共14個藥物，其中12個均在2016年之后上市。

       寡核苷酸藥物通過與信使RNA(mRNA)互補結(jié)合，干擾mRNA轉(zhuǎn)錄為蛋白質(zhì)發(fā)揮藥效，通常每條鏈上含有12～30個經(jīng)化學修飾的核苷酸亞基。關于寡核苷酸藥物是按照生物制劑還是化學藥品申報注冊，目前國內(nèi)尚無明確規(guī)定；美國FDA認為化學合成寡核苷酸與小分子更類似，將其按照化學藥由藥品評估和研究中心(Center for Drug Evaluation and Research, CDER)監(jiān)管，而基于載體或啟動子驅(qū)動的寡核苷酸藥物則按照生物制劑由生物制品評價和研究中心(Center for Biologics Evaluation and Research, CBER)監(jiān)管。由于寡核苷酸藥物的分子尺寸介于小分子和生物制劑之間，且制造工藝相比普通小分子更復雜，多個國際人用藥品注冊技術協(xié)調(diào)會(ICH)研究指導原則(Q3A,Q3B,Q6)的適用范圍明確將寡核苷酸藥物排除在外，國內(nèi)外亦尚無針對寡核苷酸藥物藥學研究的專門指導原則。

       美國FDA曾指出關于寡核苷酸藥物的監(jiān)管存在以下挑戰(zhàn):① 對于質(zhì)量研究和標準制定方面均無明確指導原則。② 由于寡核苷酸藥物的多樣性，包括單鏈反義寡核苷酸、剪接調(diào)節(jié)劑、適配體和免疫調(diào)節(jié)劑、雙鏈siRNA(通過RNAi機制發(fā)揮作用)等，而這些不同作用機制的藥物會有不同的毒理學特征，從而導致不同的問題。③ 對于雜質(zhì)的鑒定限和質(zhì)控限尚無明確共識。④ 雜質(zhì)表征存在困難，由于寡核苷酸雜質(zhì)與主成分性質(zhì)非常接近，導致分析方法對于雜質(zhì)之間及雜質(zhì)與主成分之間的分離能力存在很大挑戰(zhàn)。

       本文討論的范圍是化學合成的寡核苷酸藥物，不包括通過重組和酶法制備的mRNA等。本文將結(jié)合已上市化學合成寡核苷酸藥物的審評報告、歐洲制藥業(yè)成立的寡核苷酸聯(lián)盟(EPOC)發(fā)布的一系列技術白皮書、相關文獻等進行分析，對化學合成寡核苷酸原料藥(API)所用起始物料的藥學研究進行探討，以期為國內(nèi)化學合成寡核苷酸藥物的研發(fā)提供參考。本文中所闡述的觀點除明確有官方出處外，其余均為個人觀點，不作為藥品申報的依據(jù)。

       01

       已上市寡核苷酸藥物及其化學結(jié)構(gòu)修飾

       天然核苷酸成藥性方面存在以下問題：① 體內(nèi)穩(wěn)定性差。② 難以被靶細胞攝取。③ 脫靶效應。因此，需對天然核苷酸進行化學修飾，以增加穩(wěn)定性、提高對靶點的親和力、促進細胞攝取，并提高體內(nèi)的生物利用度。

       寡核苷酸藥物的化學修飾可分為3類：① 核苷酸間鏈接的修飾：最常見的為硫代磷酸酯修飾，其中磷酸二酯鍵中的氧被硫取代，由于硫代磷酸酯為手性結(jié)構(gòu)，這也通常會導致API由2n(n為硫代數(shù)量)個非對映異構(gòu)體組成。② 糖環(huán)的修飾：由于核糖的2′位為羥基，對其進行修飾還可以防止副反應的發(fā)生，常見的修飾包括：2′-OMe, 2′-F,2′-O-MOE(甲氧乙基)、2′-脫氧；此外，還有采用嗎啉環(huán)代替糖環(huán)的修飾方式(如已上市的viltolarsen, golodirsen, eteplirsen)以及2′,4′形成橋環(huán)的修飾方式。③ 雜環(huán)堿基的修飾：常見的修飾包括嘧啶環(huán)上C5位甲基取代。

       除了前述的化學修飾外，結(jié)構(gòu)優(yōu)化的另一個有效方式是與綴合物偶聯(lián)，以改善寡核苷酸藥物在特定組織的分布和細胞攝取，綴合物可以是多肽、蛋白質(zhì)、碳水化合物、適配體和膽固醇、生育酚或葉酸等小分子，目前已有多個靶向肝臟的N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)綴合物偶聯(lián)寡核苷酸藥物獲批上市，GalNAc可以降低毒性、提高藥效、改善藥動學(PK)性質(zhì)、降低脫靶效應。此外，遞送系統(tǒng)也是非常重要和熱門的研究及應用領域，可以改善寡核苷酸藥物在體內(nèi)分布、細胞攝取并降低毒性，如已上市藥物patisiran采用納米脂質(zhì)體(LNP)遞送。遞送系統(tǒng)屬于制劑的范疇，不在本文討論范圍。

       經(jīng)查詢歐洲EMA的官方評估報告(EPAR),本文總結(jié)了歐盟上市寡核苷酸藥物API的結(jié)構(gòu)特點、制備方法、制劑類型及處方，見表2。

       可以看出所有寡核苷酸藥物均采用固相合成工藝，制劑均為注射液(給藥途徑包括皮下注射、靜脈注射、鞘內(nèi)注射)且大部分為簡單溶液型注射液。這些寡核苷酸藥物在磷酸酯、核糖、堿基結(jié)構(gòu)以及鏈末端(綴合物)均有不同程度的修飾。

       02

       固相合成工藝

       寡核苷酸API采用固相合成工藝(見圖1),在裝有固相載體(成分為化學修飾的樹脂或玻璃)的填充柱上通過計算機編程控制進行自動化合成，整個寡核苷酸樹脂的合成是連續(xù)進行的。

       固相合成具有穩(wěn)定、高產(chǎn)率、高化學選擇性以及廣泛的洗滌步驟優(yōu)勢，合成結(jié)果高度可控及可預測，整個制備工藝包括6步。

       ① 從3′到5′端在固相載體上逐步偶聯(lián)核苷酸(通常采用保護的核苷亞磷酰胺進行),得到寡核苷酸樹脂，每個循環(huán)包括：脫除核糖5′的DMT保護基，暴露核糖的5′-OH連接位點；與下一個核苷亞磷酰胺偶聯(lián)得到亞磷酸二酯；亞磷酸二酯不穩(wěn)定，需將Ⅲ價的磷氧化為V價的磷酸酯(P=O)或硫代磷酸酯(P=S);封端/帶帽，加入?；噭?，以封蓋由于不完全偶聯(lián)或脫保護副反應而殘留的任何未反應的羥基中心，從而防止此類雜質(zhì)的傳遞。

       靶向配體可以類似的方式偶聯(lián)至樹脂上，最后一個核苷酸的DMT保護基可在該步或者裂解后進行脫除；在偶聯(lián)完成后，胺洗可脫除主鏈保護基(常見為磷羥基的氰乙基保護基),得到堿基被保護的寡核苷酸樹脂。

       對于20聚體寡核苷酸，這意味著共有80個合成步驟依次進行，過程中沒有分離的中間體，因此在以上每一步反應后都要用溶劑對樹脂進行多次洗滌，以去除多余的物料，避免殘留至后續(xù)步驟中生成雜質(zhì)。

       ② 用氨水處理可以脫除堿基上氨基的保護基，同時將寡核苷酸從樹脂上裂解下來，將寡核苷酸與樹脂分離，得到單鏈寡核苷酸粗品。

       ③ 粗品經(jīng)過液相色譜純化，通常采用強陰離子交換色譜柱(SAX)。與API非密切相關的雜質(zhì)(如鏈長度顯著不同于API的雜質(zhì))在色譜純化步驟中很容易被分離，但此步驟中不會去除鏈長度為全長(或接近全長)的寡核苷酸雜質(zhì)。

       ④ 脫鹽/濃縮：通過超濾/滲濾來交換反離子(如果需要)并濃縮寡核苷酸溶液?？赏ㄟ^配備膜的切向流過濾設備實現(xiàn)，根據(jù)膜的孔徑截止尺寸去除殘留的有機溶劑、鹽和低分子量雜質(zhì)?；蛘呖梢赃M行一系列基于乙醇的寡核苷酸沉淀及隨后從水中復溶去除低分子量雜質(zhì)和濃縮寡核苷酸。

       ⑤ 單鏈寡核苷酸通過退火(加熱到高溫，再緩慢降溫)形成雙鏈寡核苷酸，若API為單鏈，則無需退火。

       ⑥ 寡核苷酸溶液通過凍干的方式得到固體API。

       03

       起始物料

       3.1 起始物料的選擇

       由于寡核苷酸藥物制造工藝的復雜性，API中存在的寡核苷酸類雜質(zhì)譜的復雜性，雜質(zhì)研究、表征和控制的挑戰(zhàn)性及局限性，要保證API批間質(zhì)量的一致性，遵循從源頭控制質(zhì)量的理念和良好的藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)生產(chǎn)是非常重要的,因此起始物料的控制是關鍵的一環(huán)。

       ICH Q11為評估起始物料對成品質(zhì)量的影響程度提供了科學的基于風險的框架，雖然ICH Q11明確指出寡核苷酸不在范圍之內(nèi)，但其中概述的起始物料選擇的理念仍然適用。

       歐盟上市寡核苷酸藥物的審評報告說明申請人參照ICH Q11選擇了合理的起始物料，審評報告中披露的起始物料選擇策略見表2,除inotersen和nusinersen未提及外，其他所有寡核苷酸藥物均選擇保護的核苷亞磷酰胺作為起始物料(文中的核苷亞磷酰胺、酰胺、保護的酰胺等措辭均指保護的核苷亞磷酰胺),另外，有2個品種明確將預加載一個亞基的固相載體作為起始物料。

       EPOC聯(lián)盟在其技術白皮書中指出，核苷亞磷酰胺采用標準的化學制造方法，質(zhì)量良好的核苷亞磷酰胺物料已能從第三方供應商處廣泛獲得，其作為起始物料已被廣泛接受。但是對于綴合物以及預加載亞基的固相載體作為起始物料尚無明確共識，隨著商業(yè)化的可及性及對起始物料質(zhì)量認知的深入，可能會逐漸形成共識?？傊?，應參照ICH Q11對起始物料選擇的合理性進行論證。

       值得注意的是，多個寡核苷酸藥物的歐盟審評報告中均指出，若將來新增起始物料供應商，在變更獲得官方批準后才能實施(歐盟根據(jù)風險將上市后變更分為一般變更和重大變更，重大變更需經(jīng)過監(jiān)管機構(gòu)批準后才能實施),可見監(jiān)管機構(gòu)認為寡核苷酸藥物中起始物料供應商變更對產(chǎn)品質(zhì)量帶來的風險較大。這種風險源于起始物料中的關鍵雜質(zhì)會通過相似的合成路徑衍生至API中，成為與API同樣長度的關鍵雜質(zhì)，且不易通過純化去除。對于一種20聚寡核苷酸藥物，若每個起始物料核苷亞磷酰胺中含有某一類關鍵雜質(zhì)，即使在起始物料中的含量水平僅0.05%,最終會在API中生成1.0%(20×0.05%)的雜質(zhì)。因此，起始物料應盡可能不存在關鍵雜質(zhì)，一方面是為了保證API的質(zhì)量，另一方面雜質(zhì)的產(chǎn)生會造成高昂成本浪費?？傊x擇能提供良好質(zhì)量的起始物料供應商是非常重要的，對于起始物料供應商的變更應進行充分的評估和研究。

       3.2 起始物料的質(zhì)量控制

       起始物料根據(jù)其類型可分為核苷亞磷酰胺(脫氧酰胺、2′修飾酰胺、復雜酰胺)、綴合物酰胺、預加載亞基的固相載體，應根據(jù)起始物料的性質(zhì)及其對API質(zhì)量的影響建立合理的質(zhì)量標準。核苷亞磷酰胺和綴合物酰胺的質(zhì)量控制項目包括性狀、鑒別、有關物質(zhì)(包括異構(gòu)體)、殘留溶劑、31P純度、水分、含量等。預加載亞基的固相載體質(zhì)量控制項目包括物理性質(zhì)(粒度、膨脹度、堆密度等)、加載亞基的量、質(zhì)量(性狀、鑒別、有關物質(zhì)、殘留溶劑、水分)等。起始物料的質(zhì)量控制中最有難度的項目是有關物質(zhì)，應對起始物料的雜質(zhì)譜分布進行分析，了解雜質(zhì)的來源、衍生、去除情況，評估各雜質(zhì)對API質(zhì)量的影響，從而設定合理的特定雜質(zhì)、單雜、總雜的限度。

       在起始物料的雜質(zhì)研究中，歐盟審評報告及EPOC均提到了起始物料中的雜質(zhì)根據(jù)與主鏈樹脂的反應性和被工藝清除的能力將其分為兩大類，關鍵雜質(zhì)和非關鍵雜質(zhì)：關鍵雜質(zhì)是指具有與起始物料相似的反應基團(通常指含有亞磷酰胺及DMT基團的雜質(zhì)),能與樹脂鏈反應并衍生至API生成全長雜質(zhì)，這類雜質(zhì)通常無法通過強陰離子色譜被清除；非關鍵雜質(zhì)是指不與樹脂鏈反應或即使反應也易被清除，最終不影響成品純度。

       起始物料的雜質(zhì)譜與其合成工藝相關，常見類型起始物料的合成工藝及關鍵、非關鍵雜質(zhì)分析如下。

       3.2.1 脫氧核苷亞磷酰胺(簡稱脫氧酰胺)

       固相合成通過樹脂的5′-OH與下一個核苷酸的磷酰胺反應生成磷酸二酯鍵，因此脫氧核苷亞磷酰胺(結(jié)構(gòu)式見圖2)需要保護5′-OH(通常用三苯甲基DMT保護)、磷羥基(通常用氰乙基CE保護)、堿基上的伯氨(通常用?；Ｗo)。

       脫氧酰胺以發(fā)酵來源的天然脫氧核苷為起始物料(合成路線示例見圖3),先對堿基上的伯氨基進行保護(由于胸腺嘧啶無伯氨基無需進行保護),然后5′-OH經(jīng)DMT保護，再與磷試劑制備得到。

       脫氧酰胺的合成過程雖然不會產(chǎn)生新的手性碳，但會產(chǎn)生手性磷中心，導致脫氧酰胺是一對非對映異構(gòu)體的混合物(在31P-NMR中為雙峰),EPOC指出起始物料中磷的絕 對構(gòu)型不會影響API中非對映異構(gòu)體的分布。API中非對映異構(gòu)體的分布由偶聯(lián)反應中的其他因素決定，可能機制為偶聯(lián)反應中，手性磷被四氮唑活化時會迅速發(fā)生消旋，后續(xù)硫代反應的立體選擇性受磷周圍手性基團的影響，最終硫代磷酸酯雖然會存在過剩的磷異構(gòu)體比例，但通常在40∶60～60∶40之間;美國FDA也曾指出異構(gòu)體的比例受活化劑影響，不受起始物料構(gòu)型影響。因此EPOC指出無需控制起始物料中的磷異構(gòu)體比例。

       脫氧酰胺中常見雜質(zhì)見表3,關鍵雜質(zhì)(同時含有磷酰胺基團和DMT保護基團)為3′和5′-OH保護基相反的雜質(zhì)以及堿基未被保護的雜質(zhì)，可以通過嚴格的脫氧酰胺質(zhì)量標準進行控制。脫氧酰胺的質(zhì)量標準側(cè)重于控制關鍵雜質(zhì)和整體純度，可以采用HPLC法以及31P NMR法檢測雜質(zhì)和純度水平。

       3.2.2 2′修飾的核苷亞磷酰胺(簡稱2′修飾酰胺)

       對于2′修飾(-OMe、-F、-OMOE)的核苷亞磷酰胺(結(jié)構(gòu)見圖4)

       以天然核糖核苷為起始物料，可通過對2′OH進行修飾(修飾后的2′位為惰性反應位點，不再參與反應),后續(xù)的上DMT保護基及合成亞磷酰胺步驟與前述脫氧核苷相同。常見的2′-OMOE核苷亞磷酰胺的合成路線見圖5。

       2′修飾酰胺中關鍵雜質(zhì)見表4。關鍵雜質(zhì)(同時含有磷酰胺基團和DMT保護基團)除了與脫氧酰胺類似的3′和5′-OH保護基相反的雜質(zhì)和堿基未被保護的雜質(zhì)外，還包括2′-O烷基修飾的雜質(zhì)、2′和5′-OH保護基相反的雜質(zhì)，可以通過嚴格的脫氧酰胺質(zhì)量標準進行控制。脫氧酰胺的質(zhì)量標準側(cè)重于控制關鍵雜質(zhì)和整體純度，可以采用HPLC法(HPLC-UV,HPLC-MS)以及31P NMR來檢測雜質(zhì)和純度水平。

       3.2.3 其他復雜的酰胺

       脫氧酰胺和2′修飾酰胺的質(zhì)量控制要點亦適用于更復雜的酰胺類型，如2′,4′橋環(huán)核苷亞磷酰胺(LNAs)、磷酸嗎啉寡核苷酸(PMOs),結(jié)構(gòu)見圖6。

       這類更復雜酰胺的供應鏈可能不如前面所述的脫氧酰胺和2′修飾酰胺完善，而且合成路線更多樣，應通過具體合成路線具體分析潛在的關鍵雜質(zhì)。有文獻提到，LNAs的關鍵雜質(zhì)包括橋環(huán)上甲基的異構(gòu)體以及脫甲基雜質(zhì)。

       3.2.4 綴合物

       綴合物包括小分子的膽固醇(cholesterol)、生育酚(tocopherol)、茴香胺(anisamide)、葉酸(folic acid)、多肽(peptides)、茴香酰胺(anandamide)、GalNAc、聚乙二醇醚(PEG)和大分子的抗體、適配體等。小分子綴合物通過適當?shù)倪B接子與寡核苷酸共價連接。

       GalNAc能通過與積木蛋白受體(ASGR)結(jié)合，將化學修飾的寡核苷酸靶向遞送至肝細胞。盡管GalNAc綴合物的化學修飾可以采取多種形式，但它們保留了共同的特征，即幾個GalNAc部分(通常為3個，形成三觸角結(jié)構(gòu))通過接頭連接到寡核苷酸。GalNAc可在固相合成最后的5′-端引入，也可通過預加載GalNAc的固相載體在3′-端引入。

       具有雙賴氨酸部分的典型GalNAc綴合物結(jié)構(gòu)見圖7。通過天然糖和氨基酸反應制備得到單一立體異構(gòu)體結(jié)構(gòu)，其存在的潛在雜質(zhì)包括乳糖胺脫乙酰基雜質(zhì)等。目前，GalNAc綴合物在商業(yè)環(huán)境中的應用是一個非常不成熟的領域，應根據(jù)綴合物的合成工藝及結(jié)構(gòu)特點進行工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)的分析。

       3.2.5 固相載體和預加載亞基的樹脂

       固相載體雖然不是API的組成部分，但是其良好的質(zhì)量控制有利于API合成工藝的穩(wěn)健性，其關鍵質(zhì)量屬性包括：性狀、鑒別(IR)、DMT含量(紫外法)、雜質(zhì)(HPLC法)。

       雖然酰胺偶聯(lián)的產(chǎn)率通常非常高，由于空間位阻或者樹脂連接子上仲醇的反應性較低導致第一個亞基的偶聯(lián)可能較困難，可以采用預加載一個亞基的樹脂進行API的制備[已上市藥物(如inclisiran, givosiran等)采用預加載GalNAc的固相載體]。預加載亞基的固相載體質(zhì)量控制項目包括物理性質(zhì)(粒度、膨脹度、堆密度等)、加載亞基的量、質(zhì)量(性狀、鑒別、有關物質(zhì)、殘留溶劑、水分)等。由于樹脂的質(zhì)量表征方法有限，在論證預加載亞基的樹脂作為起始物料時，還應注意從分析方法能否充分控制關鍵質(zhì)量屬性(尤其是對關鍵雜質(zhì)的控制)的角度論證其作為起始物料的必要性和合理性。

       04

       結(jié)語

       由于寡核苷酸藥物制造工藝的復雜性以及API中存在的寡核苷酸類雜質(zhì)譜的復雜性，雜質(zhì)研究、表征和控制的挑戰(zhàn)性及局限性，要保證API批間質(zhì)量的一致性應遵循從源頭控制的理念和良好的GMP生產(chǎn)，嚴格控制起始物料的質(zhì)量，在申報注冊時應參照ICH Q11對起始物料選擇的合理性進行論證。相比傳統(tǒng)小分子藥物，寡核苷酸藥物對起始物料的質(zhì)量要求更為嚴苛，因此應選擇那些能持續(xù)提供良好質(zhì)量起始物料的供應商，而且在變更供應商時應更為慎重。