三陰性乳腺癌（TNBC）是一種高度異質(zhì)性的疾病，展現(xiàn)出極高的侵襲性，常規(guī)的內(nèi)分泌治療或化療對此類癌癥通常無效。之前的研究表明TNBC缺乏有效的生物標志物來指導治療決策和預測治療反應，因此從新的角度理解TNBC病理生物學特性尤為重要。
三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)指的是染色質(zhì)在細胞核中的空間排列，包括染色質(zhì)區(qū)域如何折疊、聚集以及它們?nèi)绾闻c核小體和其他核內(nèi)結(jié)構(gòu)相互作用。在腫瘤中，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的異常重組可能導致染色質(zhì)可及性變化，進而激活原本靜默的致癌基因，或抑制抑癌基因表達；染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變也可以通過影響染色體表觀遺傳標記從而調(diào)控基因的表達。然而，盡管三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對腫瘤表型的影響非常關鍵，但TNBC三維基因組的調(diào)控機制仍知之甚少。
2024年8月28日，廣東省人民醫(yī)院、中山大學、廣州市婦女兒童中心、桂林醫(yī)科大學附屬醫(yī)院及順德醫(yī)院的聯(lián)合科研團隊，以趙蔚和李杰兩位教授為通訊作者，在 Nature Cancer 期刊發(fā)表了題為：Phase separation of phospho-HDAC6 drives aberrant chromatin architecture in triple-negative breast cancer 的研究論文。
該研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化形式的HDAC6蛋白在三陰性乳腺癌（TNBC）細胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域形成了液-液相分離（LLPS）凝聚體，而在非TNBC中這種現(xiàn)象較少見。研究還鑒定出Nexturastat A作為磷酸化HDAC6 LLPS抑制劑，能夠?qū)е氯旧|(zhì)結(jié)構(gòu)重塑和轉(zhuǎn)錄譜改變，有效抑制TNBC的腫瘤生長。該研究首次揭示了TNBC中存在磷酸化形式的HDAC6蛋白，提出了通過干預磷酸化HDAC6的相分離治療TNBC的新策略。
該研究顯示，與非TNBC及相鄰非癌組織相比，TNBC中HDAC6在細胞核表達顯著增加，且主要以磷酸化形式存在。通過對HDAC6的潛在磷酸化位點進行突變分析，發(fā)現(xiàn)特定位點Ser 22的磷酸化對其核內(nèi)定位至關重要，這種磷酸化狀態(tài)與腫瘤的分期及轉(zhuǎn)移顯著相關，并與患者的總生存期負相關。超分辨率顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，TNBC細胞中磷酸化HDAC6傾向于在細胞核中形成LLPS的凝聚體，這些凝聚體主要分布在活躍的染色質(zhì)區(qū)域，并與轉(zhuǎn)錄活躍相關的標記物共定位。此外，該研究還觀察到表皮生長因子（EGF）能通過特定的激酶GRK2顯著增加磷酸化HDAC6的水平和凝聚體形成。
接下來，研究團隊探討了HDAC6的兩個主要固有無序區(qū)域（IDRs）在相分離作用。研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6的第一個無序區(qū)域（IDR1）的刪除顯著減少了磷酸化HDAC6的相分離，而第二個無序區(qū)域（IDR2）的刪除則對相分離沒有顯著影響。此外，IDR1內(nèi)Ser 22位點的磷酸化狀態(tài)對其相分離能力有重要影響。進一步的實驗表明，HDAC6的特定結(jié)構(gòu)域，如核輸出信號（NES）域的刪除，顯著增強了HDAC6在核內(nèi)的定位和相分離能力。
探究腫瘤中異常LLPS凝聚體形成的機制不僅有助于理解染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在基因表達調(diào)控中的角色，而且可能為開發(fā)新的治療策略提供線索。例如，NUP98-HOXA9的LLPS有助于形成廣泛的超級增強子（SE）樣結(jié)合模式，從而促進白血病基因的轉(zhuǎn)錄激活。此外，趙蔚團隊之前的研究發(fā)現(xiàn)，HOXB8和FOSL1在染色質(zhì)的SE位點形成的LLPS導致了骨肉瘤中轉(zhuǎn)錄的失調(diào)。盡管LLPS在癌癥中具有重要作用，但如何特異性破壞癌癥中LLPS凝聚體仍有待探索。
研究團隊通過基于相分離蛋白的篩選，發(fā)現(xiàn)了一種名為Nexturastat A的HDAC6抑制劑，該抑制劑能有效地抑制TNBC中磷酸化HDAC6凝聚體的形成。相比之下，另一種HDAC6抑制劑HPOB則未能達到相同的效果。實驗表明，Nexturastat A通過降低磷酸化HDAC6的LLPS，從而抑制TNBC細胞的增殖、瘤球形成能力和侵襲性，同時促進細胞凋亡。Nexturastat A在體內(nèi)顯著抑制了TNBC的生長。此外，Nexturastat A顯示出極低的非癌細胞毒性，表明其具有良好的安全性。
Nexturastat A能夠顯著改變HDAC6與其相互作用蛋白之間的互作，尤其是降低與14-3-3θ的結(jié)合，后者是已知的LLPS的潛在參與因子。Nexturastat A的處理還減少了磷酸化HDAC6與進出核運輸?shù)鞍譏mportin β的相互作用，這一過程依賴于HDAC6的S22位點。此外，研究還揭示了NUP153在磷酸化HDAC6進入細胞核過程中的關鍵作用。
隨后，研究團隊詳細探討了Nexturastat A對TNBC染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。通過Hi-C分析發(fā)現(xiàn)，Nexturastat A處理后，TNBC細胞的全基因組染色質(zhì)相互作用發(fā)生了顯著變化，特別是在開放和封閉染色質(zhì)區(qū)域的重新分布。此外，Nexturastat A的治療還促進了新的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，這些新環(huán)結(jié)構(gòu)富含RNA聚合酶II（Pol II）特異性DNA結(jié)合和免疫系統(tǒng)過程通路，顯示出Nexturastat A對染色質(zhì)動態(tài)具有重要的影響。
通過對Nexturastat A處理的TNBC細胞進行RNA-seq和Pol II ChIP-seq分析，揭示了Nexturastat A處理主要導致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化和轉(zhuǎn)錄模式的重新編程，這體現(xiàn)在染色質(zhì)的增加可及性和Pol II的增加結(jié)合。此外，通過ATAC-seq研究發(fā)現(xiàn)Nexturastat A處理能夠促使腫瘤抑制基因的表達上調(diào)，原癌基因表達下調(diào)，并且激活了與免疫反應相關的基因。
最后，Nexturastat A通過改變HDAC6的結(jié)合模式和H3全乙?；揎棧@著影響了染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，尤其是在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）周圍。特別地，研究團隊識別出一組基因顯示HDAC6結(jié)合和H3全乙?；囊恢伦兓?，這些基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和TP53信號通路中，包括腫瘤抑制基因ATF3。此外，ATF3敲減實驗表明，ATF3是HDAC6的一個重要下游靶標，其敲減降低了細胞對Nexturastat A治療的敏感性，影響了細胞的生存和侵襲能力。
綜上，該研究揭示了磷酸化HDAC6在TNBC中的全新作用，特別是它在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域形成的相分離凝聚體對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響。通過與14-3-3θ共凝聚，磷酸化HDAC6不僅改變了染色質(zhì)的物理結(jié)構(gòu)，還促進了特定的組蛋白乙?；揎椇娃D(zhuǎn)錄譜的重編程，從而推動了TNBC的惡性表型發(fā)展。這一發(fā)現(xiàn)不僅為我們提供了對TNBC中染色質(zhì)動態(tài)復雜性的更深層理解，還可能指明了新的治療策略，即通過調(diào)控磷酸化HDAC6來干預TNBC的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和細胞命運。
廣東省人民醫(yī)院特聘副研究員魯冰、中山大學中山醫(yī)學院博士研究生邱茹、魏嘉田、桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院研究員王力為論文共同第一作者。趙蔚教授、李杰教授為論文共同通訊作者。
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