p53簡(jiǎn)介

       p53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)腫瘤相關(guān)性最高的基因。不同于傳統(tǒng)的腫瘤因子在人類(lèi)癌癥中通常表達(dá)量下調(diào)或存在基因刪除的狀況，p53在絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中會(huì)發(fā)生突變。對(duì)不同人類(lèi)癌癥細(xì)胞進(jìn)行基因組測(cè)序的結(jié)果表明，在所有惡性腫瘤中50%以上會(huì)出現(xiàn)該基因的突變。由這種基因編碼的蛋白質(zhì)是一種轉(zhuǎn)錄因子，其控制著細(xì)胞周期的啟動(dòng)。許多有關(guān)細(xì)胞健康狀態(tài)的信號(hào)向p53蛋白發(fā)送，細(xì)胞是否進(jìn)入一個(gè)分裂周期就由其決定。如果這個(gè)細(xì)胞受損，又不能得到修復(fù)，則p53蛋白將參與啟動(dòng)過(guò)程，使這個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞凋亡(apoptosis)中死去。有p53缺陷的細(xì)胞沒(méi)有這種控制，甚至在不利條件下繼續(xù)分裂。像所有其它腫瘤抑制因子一樣，p53基因在正常情況下對(duì)細(xì)胞分裂起著減慢或監(jiān)視的作用。細(xì)胞中抑制癌變的基因“p53”會(huì)判斷DNA變異的程度，如果變異較小，這種基因就促使細(xì)胞自我修復(fù)；若DNA變異較大，“p53”就誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

       作為轉(zhuǎn)錄因子的一員，p53 蛋白結(jié)構(gòu)域分布包括序列特異的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸100-300位間；核定位信號(hào)NLS位于氨基酸殘基316-325；四聚體寡聚化結(jié)構(gòu)域，定位于氨基酸殘基334-356；C-末端非專(zhuān)一DNA調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，同時(shí)在碰到DNA損傷時(shí)，p53 可以招募其它蛋白質(zhì)到損傷部位，提供DNA損傷信號(hào)。p53蛋白主要分布于細(xì)胞核漿，能與DNA特異結(jié)合，其活性受磷酸化、乙?；?、甲基化、泛素化等翻譯后修飾調(diào)控。正常的p53蛋白在細(xì)胞中易水解，半衰期為20分鐘，突變性p53蛋白半衰期為1.4-7小時(shí)不等。

       在某些特定類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞亞型中，p53蛋白的突變率尤其高，如卵巢漿液性癌，鱗狀細(xì)胞癌及三陰性乳腺癌等。在很多類(lèi)型的腫瘤中，p53基因突變的存在往往伴隨著較差的患者預(yù)后。通常而言，超過(guò)75%的p53突變?yōu)榘l(fā)生在DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域核心區(qū)域的單個(gè)氨基酸改變，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性的喪失以及功能異常性p53蛋白的累積。在所有的p53蛋白突變中，有一些熱點(diǎn)區(qū)域，出現(xiàn)在不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞中的頻率非常高，包括氨基酸殘基R175、Y220、R248及R273等。另外，p53蛋白高頻出現(xiàn)的突變還可分為兩種類(lèi)型，分別是構(gòu)象性突變及DNA結(jié)合性突變：前者破壞了p53蛋白的結(jié)構(gòu)從而使其喪失DNA結(jié)合能力；而后者則是直接改變了同DNA結(jié)合的氨基酸殘基。兩類(lèi)突變都會(huì)導(dǎo)致p53轉(zhuǎn)錄活性的喪失，并通過(guò)與野生型蛋白的異源寡聚化而產(chǎn)生dominate-negative效應(yīng)。

       針對(duì)于p53突變型腫瘤領(lǐng)域的藥物研發(fā)，最直接的思路是誘導(dǎo)突變型p53蛋白的降解或幫助其恢復(fù)野生型的功能。進(jìn)一步的研究表明，突變型的p53蛋白還會(huì)產(chǎn)生一些致癌性功能(GOF突變，gain-of-function)，從而增加了腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移能力及藥物抗性產(chǎn)生的概率。因此，p53蛋白的突變對(duì)癌癥的發(fā)展過(guò)程起著雙重作用，一方面喪失了腫瘤抑制活性；另一方面突變后的蛋白會(huì)產(chǎn)生新的癌基因活性，從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展。而這一特性，使得p53成為腫瘤治療中靶點(diǎn)選擇的熱門(mén)候選之一。根據(jù)設(shè)計(jì)思路的不同，候選藥物可分為直接作用于突變型p53及間接作用于突變型p53蛋白兩大類(lèi)，將分別在上、下兩文中分別加以重點(diǎn)論述。其中直接作用于突變型p53蛋白的研究，又分為恢復(fù)p53野生型活性的策略及誘導(dǎo)突變型p53蛋白降解的策略。

       恢復(fù)野生型p53活性策略

       CP-31398

       苯乙烯基喹唑啉類(lèi)化合物，來(lái)源于對(duì)能夠恢復(fù)p53的DNA結(jié)合活性的高通量篩選過(guò)程。研究表明，CP-31398不僅能夠在表達(dá)突變型p53的細(xì)胞系中恢復(fù)p53的功能，還能夠顯著增加野生型p53的表達(dá)水平。采用CP-31398處理細(xì)胞，可增加p21基因的表達(dá)及細(xì)胞周期阻滯的出現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，CP-31398可誘導(dǎo)p53的線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)位，從而導(dǎo)致線(xiàn)粒體膜通透性的改變及后續(xù)細(xì)胞色素c的釋放，并進(jìn)一步引發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在攜帶有自然突變的p53的黑色素瘤及結(jié)腸癌異源移植模型中，CP-31398處理可明顯抑制兩類(lèi)腫瘤組織的生長(zhǎng)。該藥物在200mg/kg / day劑量時(shí)仍表現(xiàn)較為安全，小鼠持續(xù)給藥14天，為觀(guān)察到死亡案例出現(xiàn)。另有研究組證實(shí)，該化合物還可以修復(fù)紫外線(xiàn)誘導(dǎo)的突變導(dǎo)致的腫瘤抑制活性損傷。服用CP-31398后，不僅可以抑制UVB誘發(fā)的皮膚癌生長(zhǎng)，還可阻止其進(jìn)一步發(fā)展。上述研究表明，CP-31398是一種極具潛力的靶向突變型p53的候選藥物。

       P53R3

       采用體外DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)篩選出的新型p53功能恢復(fù)性化合物，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中可恢復(fù)內(nèi)源性表達(dá)的p53R175H及p53R273H的序列特異性DNA結(jié)合能力。P53R3抑制細(xì)胞增殖的原理在于可誘導(dǎo)p53下游靶基因的表達(dá)，如MDM2，p21，PUMA及BAX等。該化合物誘導(dǎo)的p53下游靶基因的表達(dá)似乎具有p53突變細(xì)胞特異性，在野生型細(xì)胞中該現(xiàn)象較為少見(jiàn)。另外，P53R3可強(qiáng)烈增加DR5 (death receptor 5)在細(xì)胞表面的表達(dá)量，從而使得細(xì)胞對(duì)于Apo2L/TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡更加敏感。該化合物是p53功能恢復(fù)性藥物開(kāi)發(fā)重要候選之一。

       NSC319726

       能修復(fù)突變p53R175結(jié)構(gòu)和功能。具體來(lái)說(shuō)這種化合物能通過(guò)廣泛細(xì)胞凋亡，殺死p53R175H敲除小鼠，以175等位基因特異性突變p53依賴(lài)模式，抑制異種移植腫瘤生長(zhǎng)。研究還證明，這種活性還依賴(lài)于NSC319726的鋅離子螯合特性，以及氧化還原反應(yīng)。這些數(shù)據(jù)都表明NSC319726可以作為p53R175H重新激活劑，用于p53靶向藥物研發(fā)。研究者的篩選方法比較獨(dú)特，因涉及了癌細(xì)胞的多種遺傳背景，研究者識(shí)別出的化合物可以殺死含有p53基因突變的癌細(xì)胞，其中有一種化合物可以恢復(fù)基因p53-R175H的突變，而且研究者確保人體的正常細(xì)胞是不會(huì)受這種化合物影響的。也就是說(shuō)在這項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)的NSC319726能恢復(fù)突變體的作用，并且對(duì)正常p53細(xì)胞不造成影響。

       PK7088

       p53蛋白的Y220C突變體有一個(gè)獨(dú)特的表面裂縫區(qū)域，非常適合于作為小分子穩(wěn)定劑的靶點(diǎn)，而PK7088則被篩選出可以特異性的結(jié)合并穩(wěn)定p53Y220C分子。通過(guò)恢復(fù)p53的野生型構(gòu)象，上調(diào)p21及促凋亡蛋白NOXA的表達(dá)量，PK7088可以在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生p53Y220C分子依賴(lài)性的G2/M細(xì)胞周期阻滯，細(xì)胞凋亡及生長(zhǎng)抑制。除此之外，PK7088還可以同Nutlin-3產(chǎn)生協(xié)同作用，進(jìn)一步上調(diào)p21及NOXA蛋白的表達(dá)量。

       Chetomin

       中文名毛殼菌素?？苫謴?fù)p53的轉(zhuǎn)錄激活活性，并上調(diào)MDM2，p21及PUMA的表達(dá)水平。在小鼠腫瘤異源移植模型中，chetomin可選擇性的抑制攜帶有p53R175H的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，而不是p53R273H類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞。Chetomin可結(jié)合并增強(qiáng)Hsp40同p53R175H間的相互作用，從而導(dǎo)致p53R175H的構(gòu)象變化及功能恢復(fù)。盡管如此，也有研究發(fā)現(xiàn)在表達(dá)野生型p53的結(jié)腸癌中，chetomin同樣可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，似乎表明該化合物的抗腫瘤活性不具有p53突變依賴(lài)性，有待進(jìn)一步探討。

       PEITC

       異硫氰酸苯乙酯，來(lái)源于十字花科蔬菜的天然產(chǎn)物，可以在腫瘤細(xì)胞中重新激活突變p53分子的正?；钚?。研究人員發(fā)現(xiàn)，PEITC對(duì)表達(dá)p53R175H的腫瘤細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制活性；并能恢復(fù)其野生型構(gòu)象及轉(zhuǎn)錄激活活性。與此同時(shí)，PEITC還可使得p53R175H腫瘤細(xì)胞對(duì)蛋白酶體介導(dǎo)的降解過(guò)程敏感。從作用機(jī)理上分析，PEITC通過(guò)激活經(jīng)典的p53下游靶基因，使得腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)S期及G2/M期細(xì)胞周期停滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程的發(fā)生。在小鼠的腫瘤異源移植模型中，通過(guò)飲食性補(bǔ)充PEITC能夠顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。這事首次發(fā)現(xiàn)的飲食中包含的化合物具有激活突變型p53活力的功效，為治療p53R175H型癌癥提供了一個(gè)新的思路。

       RITA

       早期研究發(fā)現(xiàn)該化合物可通過(guò)抑制p53-HDM2間的相互作用，誘導(dǎo)p53下游靶基因如p21和PUMA等分子的表達(dá)而抑制p53野生型HCT 116細(xì)胞的生長(zhǎng)，而非p53基因敲除的細(xì)胞系。進(jìn)一步研究表明，RITA可以在腫瘤細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡基因如NOXA，p21及GADD45等的表達(dá)而重新恢復(fù)突變的p53的功能，同時(shí)抑制癌基因如N-Myc和Bcl-2的表達(dá)。RITA作用機(jī)制尚未完全明確，有研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌中RITA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡并不依賴(lài)于p53的存在。在p53野生型的頭頸癌中，RITA可以增大順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞**；而在p53突變的胰 腺癌中，RITA可協(xié)同增進(jìn)吉西他濱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

       COTI-2

       最初由制藥公司Critical Outcome Technologies發(fā)現(xiàn)的第三代縮氨基硫脲類(lèi)藥物，可恢復(fù)錯(cuò)誤折疊的p53蛋白(R175H，R273H)野生活性。COTI-2同樣也是PI3K / AKT / mTOR信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)節(jié)劑。近期研究表明，不管是否含有p53突變，在體內(nèi)外的模型中COTI-1都可以降低多種腫瘤細(xì)胞的增殖，因而其同樣可能作用于PI3K / AKT / mTOR等信號(hào)通路。目前該化合物已經(jīng)進(jìn)入一期臨床研究中(NCT02433626)，用于治療晚期或復(fù)發(fā)性婦科惡性腫瘤。

       PRIMA-1

       PRIMA-1是一種突變型p53復(fù)活劑，可恢復(fù)p53突變型甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)組蛋白甲基化抑制劑3-Deazaneplanocin A的敏感性，并通過(guò)結(jié)合于核心DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。該化合物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化后會(huì)結(jié)合于突變型p53分子的巰基上，從而使整個(gè)蛋白恢復(fù)野生構(gòu)象，而重新具有抑癌活性。

       PRIMA-1Met(APR-246)

       在藥物優(yōu)化篩選過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)PRIMA-1甲基化形式的類(lèi)似物，PRIMA-1Met (APR-246)具有更強(qiáng)的藥效及更低的細(xì)胞**。APR-246通過(guò)激活caspase-3，上調(diào)促凋亡蛋白Bax及Noxa等的表達(dá)量而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。除在體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜憩F(xiàn)出色外，APR-246還同傳統(tǒng)的化療藥物在某些癌癥中存在較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)。針對(duì)APR-246的不同適應(yīng)癥已經(jīng)進(jìn)入了不同的臨床試驗(yàn)階段。在一項(xiàng)針對(duì)攜帶有p53突變的血液系統(tǒng)惡性腫瘤及前列腺癌患者的Ⅰ/Ⅱa期臨床研究中，APR-246在療效及安全性上均表現(xiàn)出色。而另一項(xiàng)Ⅰb/Ⅱ臨床試驗(yàn)正在開(kāi)展中(NCT02098343)，用以評(píng)估APR-246同卡鉑聯(lián)用針對(duì)復(fù)發(fā)性高等級(jí)卵巢癌患者的療效，該患者群體中約95%攜帶有p53基因的突變。

       誘導(dǎo)突變型p53降解策略

       Hsp90及HDAC抑制劑

       在人類(lèi)所患癌癥中，突變型p53分子往往要比野生型p53更加穩(wěn)定，原因在于HDAC6 / Hsp90組成的分子伴侶復(fù)合體與突變型p53間存在相互作用，從而阻止了突變型p53蛋白的泛素化降解。因此，理論上通過(guò)HDAC抑制劑或者Hsp90抑制劑來(lái)破壞HDAC6 / Hsp90組成的分子伴侶復(fù)合體，將會(huì)誘導(dǎo)p53突變體的降解。已發(fā)表的研究結(jié)果中，Hsp90抑制劑(如17-AAG及Ganetespib)及HDAC抑制劑(如vorinostat)可以促進(jìn)p53突變體進(jìn)入蛋白酶體依賴(lài)性的降解過(guò)程，并且這些抑制劑已經(jīng)進(jìn)入了不同的臨床試驗(yàn)階段。Hsp90抑制劑ganetespib針對(duì)非小細(xì)胞肺癌開(kāi)展了三期臨床研究，但由于療效不佳，該項(xiàng)目終止于第一次中期分析階段。盡管如此，ganetespib針對(duì)其他諸如AML，卵巢癌及乳腺癌等適應(yīng)癥的研究正處于一期及二期臨床階段。

       他汀類(lèi)藥物

       他汀類(lèi)藥物通常用于降低血液中膽固醇水平，從而治療或預(yù)防心血管疾病的發(fā)生。在一項(xiàng)針對(duì)能夠降解突變型p53化學(xué)分子庫(kù)的篩選研究中，科研人員發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)化合物可誘導(dǎo)攜帶有構(gòu)象或者折疊錯(cuò)誤的p53蛋白(V157F，R172H，R175H，Y220C，R248W，R273H及R280K)的降解。他汀類(lèi)藥物介導(dǎo)的HMG-CoA活性抑制及p53分子的降解效應(yīng)對(duì)攜帶有突變型p53的腫瘤細(xì)胞具有高度特異性，該效應(yīng)在表達(dá)有野生型p53的腫瘤細(xì)胞中較弱。另外，他汀類(lèi)藥物還同諸如阿霉素的化療藥物間存在正協(xié)同作用，并且該現(xiàn)象指發(fā)生于攜帶有p53突變的腫瘤細(xì)胞中。因此，采用他汀類(lèi)藥物對(duì)甲戊二羥酸途徑進(jìn)行抑制也代表了靶向于腫瘤細(xì)胞中突變型p53分子的一類(lèi)新型有效的藥物開(kāi)發(fā)策略。

       Gambogic acid

       中文名藤黃酸，來(lái)源于藤黃科植物藤黃樹(shù)分泌的干燥樹(shù)脂，可以上調(diào)野生型p53的表達(dá)量從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。藤黃酸還可以在轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)突變型p53在細(xì)胞內(nèi)的濃度，作用機(jī)理為通過(guò)CHIP泛素連接酶對(duì)不同的p53突變體進(jìn)行泛素化及隨后的蛋白酶體依賴(lài)性降解過(guò)程。另外，有研究表明在表達(dá)p53R280K及p53S241F的腫瘤細(xì)胞系中，藤黃酸還可通過(guò)細(xì)胞自噬過(guò)程誘導(dǎo)p53突變體的降解。

       YK-3-237

       該化合物在三陰性乳腺癌中可以誘導(dǎo)突變型p53的降解，其作用機(jī)理為通過(guò)活化蛋白質(zhì)去乙?；窼IRT1來(lái)降低不同p53突變體(V157F，M237I/R249S，R273H及R280K)的乙酰化程度。p53突變體的去乙?；瘯?huì)降低蛋白穩(wěn)定性，上調(diào)p53下游靶基因如PUMA和NOXA等的表達(dá)。在攜帶有p53突變的三陰性乳腺癌中，YK-3-237更傾向于通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及PARP依賴(lài)性的細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。盡管如此，該化合物在腫瘤異源移植模型中的效果仍有待確認(rèn)。

       Capsaicin

       辣椒素，又名辣椒堿，即反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺，是辣椒屬植物紅辣椒的活性成分。它對(duì)包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物都有刺激性并可在口腔中產(chǎn)生灼燒感。Capsaicin是一種TRPV1激動(dòng)劑，作用HEK293細(xì)胞，EC50 為0.29±0.05 μM。近期的一項(xiàng)研究表明，capsaicin可在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及乳腺癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)p53突變體蛋白(R175H，R273H)的降解。Capsaicin處理后，細(xì)胞重新具有野生型p53分子的活力，諸如PUMA及Bax表達(dá)量的上調(diào)及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡現(xiàn)象的發(fā)生等。令人感興趣的是，capsaicin同樣會(huì)降低MDR1 (multidrug resistance gene)基因的表達(dá)水平，因而可以使得腫瘤細(xì)胞重新對(duì)諸如順鉑在內(nèi)的化療藥物變得敏感。Capsaicin誘導(dǎo)突變型p53講解的分子機(jī)理，仍有待進(jìn)一步探索。

       參考文獻(xiàn)：

       1.http://p53.free.fr/

       2.Molecularly targeted therapies for p53-mutant cancers.Cell Mol Life Sci. 2017 Jun 22. doi:10.1007/s00018-017-2575-0

       3.Allele-specific p53 mutant reactivation.Cancer Cell，2012，21 (5): 614

       4.http://criticaloutcome.com/coti-2-and-pipeline/pipeline/

       5.p53 in health and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 Apr；8 (4):275-83.

       6.p53 in survival，death and metabolic health: a lifeguard with a licence to kill. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015 Jul；16 (7):393-405. doi: 10.1038/nrm4007.

       7. Awakening guardian angels: drugging the p53 pathway. Nat Rev Cancer. 2009 Dec；9(12):862-73. doi: 10.1038/nrc2763.