嵌合抗原受體(CAR)-T細(xì)胞療法是癌癥免疫細(xì)胞療法中一個(gè)革命性的新支柱，它在B細(xì)胞白血病或淋巴瘤患者中均表現(xiàn)出顯著的臨床治療效果，但CAR-T療法在面對實(shí)體瘤時(shí)卻顯得束手無策，同時(shí)CAR-T療法也存在嚴(yán)重危及生命的毒 性和有限的抗癌療效等缺陷。本文我們將介紹CAR-T細(xì)胞療法的最新研究進(jìn)展，CAR-T細(xì)胞療法的局限性以及潛在的改進(jìn)策略。

       CAR-T細(xì)胞療法的“廬山真面目”

       近年來，腫瘤靶向治療領(lǐng)域呈現(xiàn)蓬勃發(fā)展態(tài)勢。腫瘤免疫療法因具有特異性強(qiáng)，副作用小等優(yōu)勢而備受矚目，逐漸走進(jìn)大眾視野。腫瘤免疫療法的出現(xiàn)，改變了癌癥治療的發(fā)展格局。目前已經(jīng)報(bào)道了細(xì)胞因子療法、疫 苗、免疫檢查點(diǎn)抑制劑以及過繼細(xì)胞療法等免疫療法。其中，作為抗癌戰(zhàn)場“尖兵銳器”的CAR-T細(xì)胞療法異軍突起，為腫瘤靶向治療提供了新的治療選擇。

       嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法屬于過繼性細(xì)胞免疫療法（ACT）的一種，其家族還包括TIL，TCR-T療法，CAR-NK等方法。CAR-T療法是指通過單采從患者血液中收集T細(xì)胞，收集的T細(xì)胞經(jīng)過基因工程改造以表達(dá)CAR并在體外培養(yǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，然后將CAR-T細(xì)胞過繼回輸給患者的新型抗癌療法（圖1）。

       嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）是指將能識(shí)別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結(jié)合部與CD3-ζ鏈或FcεRIγ的胞內(nèi)部分在體外偶聯(lián)為一個(gè)嵌合蛋白，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染患者的T細(xì)胞的一類免疫細(xì)胞。CAR主要由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域這三個(gè)功能域構(gòu)成（圖1）。目前一共開發(fā)了四代CAR-T細(xì)胞，其中三代、四代的CAR-T技術(shù)仍處于研發(fā)階段；臨床上應(yīng)用最多的是第二代CAR-T細(xì)胞，在已上市的CAR-T療法中均采用第二代CAR-T技術(shù)。

       圖1. CAR-T細(xì)胞療法原理及四代CAR-T細(xì)胞結(jié)構(gòu)

       CAR-T細(xì)胞其實(shí)是相當(dāng)于在T細(xì)胞上裝上定位導(dǎo)航裝置CAR，將普通T細(xì)胞改造成“超級戰(zhàn)士”，并利用其定位導(dǎo)航裝置CAR，特異性識(shí)別體內(nèi)腫瘤細(xì)胞，通過激活免疫反應(yīng)釋放免疫活性物質(zhì)，產(chǎn)生免疫效應(yīng)，從而高效殺死腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到治療惡性腫瘤的效果（圖2）。

       圖2. CAR-T細(xì)胞療法作用機(jī)制

       CAR-T細(xì)胞療法的“美中不足”

       嵌合抗原受體CAR-T細(xì)胞療法具有革命性意義，因?yàn)樗a(chǎn)生了有效和持久的臨床反應(yīng)。CAR與細(xì)胞表面表達(dá)的靶抗原結(jié)合，并且不依賴MHC受體，使T細(xì)胞活化，并產(chǎn)生強(qiáng)效的抗腫瘤反應(yīng)。然而，CAR-T細(xì)胞療法仍存在必須解決的局限性，包括危及生命的CAR-T細(xì)胞相關(guān)毒 性、對實(shí)體瘤的療效有限、B細(xì)胞惡性腫瘤的抑制和耐藥性、抗原逃逸、有限的持久性、有限的轉(zhuǎn)運(yùn)能力和腫瘤浸潤能力，以及免疫抑制微環(huán)境等。

       1 抗原逃逸

       CAR-T細(xì)胞療法最大挑戰(zhàn)是腫瘤對單抗原靶向CAR的耐藥性問題（圖3）。盡管最初的單抗原靶向CAR-T細(xì)胞表現(xiàn)出高應(yīng)答率，但這些CAR-T細(xì)胞治療的很大一部分患者的惡性細(xì)胞表現(xiàn)出部分或完全喪失靶抗原表達(dá)等抗原逃逸現(xiàn)象。

       一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，盡管70-90%復(fù)發(fā)性或難治性ALL（急性淋巴細(xì)胞白血病）患者對靶向CD19的CAR-T 細(xì)胞療法表現(xiàn)出持久反應(yīng)，但在臨床應(yīng)用中卻出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，并且30-70%的患者在治療后出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)。

       同樣，在接受靶向BCM的CAR-T細(xì)胞治療的多發(fā)性骨髓瘤患者中，也觀察到BCMA表達(dá)下調(diào)或缺失。此外，在實(shí)體瘤中也觀察到類似的抗原逃逸抗性現(xiàn)象。為了降低CAR-T 細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤的復(fù)發(fā)率，現(xiàn)在許多策略都依賴于開發(fā)靶向多種抗原的CAR。目前使用雙靶向CAR-T細(xì)胞（CD19/CD22或CD19/BCMA）的臨床試驗(yàn)也顯示出積極的結(jié)果。

       圖3. 腫瘤細(xì)胞抗原逃逸

       2 靶向腫瘤外效應(yīng)

       研究表明實(shí)體瘤抗原通常也在正常組織上以不同水平表達(dá)，靶向?qū)嶓w瘤抗原的CAR可能也會(huì)靶向正常細(xì)胞，從而造成不必要的毒 性（圖4）。因此，抗原選擇在CAR設(shè)計(jì)中至關(guān)重要：不僅要確保治療效果，還要避免“靶向腫瘤外”毒 性的發(fā)生。此外，解決靶向腫瘤外效應(yīng)的潛在策略是靶向腫瘤限制性翻譯后修飾的靶點(diǎn)，例如靶向?qū)嶓w瘤過表達(dá)的截短O-聚糖等。

       圖4. 靶向脫瘤效應(yīng)

       3 有限的CAR-T細(xì)胞運(yùn)輸和腫瘤浸潤能力

       與血液系統(tǒng)惡性腫瘤相比，實(shí)體瘤CAR-T細(xì)胞治療受限于CAR-T細(xì)胞運(yùn)輸和浸潤實(shí)體瘤的能力，因?yàn)槊庖咭种菩阅[瘤微環(huán)境和腫瘤間質(zhì)等物理腫瘤屏障限制了CAR的滲透和T細(xì)胞的移動(dòng)（圖5）。

       研究表明，采用局部給藥可以改善這些缺陷。因?yàn)榫植拷o藥避免了CAR-T細(xì)胞運(yùn)輸?shù)郊膊〔课坏男枰约皽p少了靶向脫瘤效應(yīng)，這樣CAR-T細(xì)胞只靶向腫瘤細(xì)胞，可以最大限度地減少與正常組織的相互作用。此外，臨床前研究已經(jīng)證實(shí)了腦室內(nèi)注射靶向HER2和IL13Ra2的CAR-T細(xì)胞的顯著療效。

       圖5. 有限的腫瘤的運(yùn)輸和浸潤能力

       4 腫瘤免疫抑制微環(huán)境

       在腫瘤微環(huán)境中，許多驅(qū)動(dòng)免疫抑制的細(xì)胞類型可以浸潤實(shí)體瘤，包括髓源性抑制細(xì)胞 (MDSCs)、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞 (TAMs) 和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Tregs)。這些細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子和生長因子，從而影響CAR-T細(xì)胞的浸潤，進(jìn)而影響CAR-T細(xì)胞療效（圖6）。

       此外，研究表明PD-1或CTLA-4 等免疫檢查點(diǎn)途徑可降低抗腫瘤免疫力。因此，CAR-T細(xì)胞療法和免疫檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合免疫療法被認(rèn)為是下一個(gè)免疫療法前沿。盡管免疫檢查點(diǎn)抑制劑和CAR-T細(xì)胞療法的聯(lián)合療法可能是一種新的免疫療法選擇，但需要注意的是，這種組合療法仍可能不足以誘導(dǎo)T細(xì)胞浸潤和效應(yīng)功能。

       圖6. 腫瘤免疫抑制微環(huán)境

       5 CAR-T細(xì)胞相關(guān)毒 性

       CAR-T細(xì)胞療法是一種革命性的癌癥治療工具，但其高毒 性和一些致死率阻礙了CAR-T細(xì)胞療法成為一線療法（圖7）。研究表明，決定CRS、HLH/MAS 和/或ICANS的發(fā)生率和嚴(yán)重程度的關(guān)鍵因素是CAR的設(shè)計(jì)、特定靶點(diǎn)和腫瘤類型。

       目前CAR-T細(xì)胞療法的毒 性已經(jīng)在接受第一個(gè)FDA批準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞治療的患者中得到證實(shí)，即使在最顯著的臨床試驗(yàn)中，患者中也發(fā)生了嚴(yán)重危及生命的毒 性事件。在接受CAR-T細(xì)胞治療的急性淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤（ALL/LBL）患者中，幾乎所有患者都至少有一些輕微的毒 性表現(xiàn)，大約23-46%的患者表現(xiàn)出嚴(yán)重的超生理細(xì)胞因子產(chǎn)生和大量體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增。然而，目前還沒有有效的策略來預(yù)防上述毒 性，因此，必須優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)并采用其他策略來降低CAR引起的毒 性。

       圖7. CAR-T細(xì)胞相關(guān)的毒 性

       CAR-T細(xì)胞療法的“與日俱進(jìn)”

       為了實(shí)現(xiàn)有效的治療反應(yīng)，CAR-T細(xì)胞抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域必須結(jié)合其靶表位并達(dá)到誘導(dǎo)CAR-T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子分泌的最低閾值水平。CAR-T細(xì)胞必須保持在其治療窗口內(nèi)才能在臨床上有效，因?yàn)槌^治療窗口會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子和免疫系統(tǒng)激活，進(jìn)而產(chǎn)生毒副作用。因此，優(yōu)化CAR-T細(xì)胞以提高治療效果和限制毒 性至關(guān)重要。

       1 改造優(yōu)化CAR結(jié)構(gòu)

       降低毒 性的一種途徑是通過改變CAR-T細(xì)胞抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力。降低抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力會(huì)導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞上更高抗原密度的需求增加，以實(shí)現(xiàn)高水平的激活。因此，可以通過降低抗原親和力，避免靶向低表達(dá)量抗原的健康組織的情況發(fā)生。此外，也可以通過修飾CAR的鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)來調(diào)節(jié)CAR-T細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌。

       研究表明，優(yōu)化鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)可能是降低毒 性的有用方法，一項(xiàng)I期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)改良鉸鏈區(qū)和跨膜區(qū)的CAR，可導(dǎo)致54.5%的B細(xì)胞淋巴瘤患者完全緩解。同樣，也可以根據(jù)腫瘤類型、腫瘤負(fù)荷、抗原密度、靶抗原-抗原結(jié)合域改造CAR-T共刺激域以降低毒 性。

       2 降低CAR免疫原性

       人體自身宿主免疫系統(tǒng)對CAR的識(shí)別可能導(dǎo)致細(xì)胞因子介導(dǎo)的相關(guān)毒 性產(chǎn)生。因此，利用人類或人源化抗體片段代替鼠源性CAR來降低CAR免疫原性可能是降低毒 性的有效策略。此外，通過修飾鉸鏈和/或跨膜結(jié)構(gòu)域也可以降低CAR的免疫原性，并且修飾后的CAR-T 細(xì)胞的持久性也得到改善。

       3 修飾CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞

       CAR-T治療最常見的副作用是細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）和神經(jīng)毒 性。CRS是指在免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞作用的過程中，大量釋放細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子又會(huì)引發(fā)進(jìn)一步的連鎖反應(yīng)，如過度炎癥反應(yīng)、毛細(xì)血管滲漏、凝血級聯(lián)反應(yīng)等，進(jìn)而導(dǎo)致器官受損和腦腫脹，最終危及生命。研究表明，修飾CAR轉(zhuǎn)導(dǎo)的 T細(xì)胞有助于減少CRS的發(fā)生和降低神經(jīng)毒 性。

       4 CAR“關(guān)閉開關(guān)”策略

       改善CAR-T細(xì)胞毒 性的另一個(gè)潛在途徑是通過實(shí)施“關(guān)閉開關(guān)”或自殺基因策略。但自殺策略或其他類似方法的最大限制是，盡管它們在確保安全方面很有吸引力，但它們的使用會(huì)突然停止對快速發(fā)展疾病的治療。這種方法可以暫時(shí)抑制CAR-T細(xì)胞功能，并可以在毒 性消退后挽救CAR-T細(xì)胞療法。未來，有必要開發(fā)更多有效策略，可以暫時(shí)抑制CAR-T細(xì)胞功能并在毒 性消退后進(jìn)行CAR-T 細(xì)胞治療救援，這對于CAR-T細(xì)胞療法邁向血液學(xué)的一線治療是至關(guān)重要的。

       圖8. CAR-T細(xì)胞療法潛在的改進(jìn)策略

       CAR-T細(xì)胞療法的研究進(jìn)展

       近年來，隨著CAR-T細(xì)胞療法領(lǐng)域的持續(xù)升溫，國內(nèi)外多家藥企布局CAR-T療法，國外方面包括諾華、BMS、吉利德等制藥巨頭，國內(nèi)也有藥明巨諾、傳奇生物、復(fù)星醫(yī)藥、信達(dá)等藥企參與布局。迄今為止，全球獲批上市的CAR-T療法共有7種，其中，Kymriah是諾華研發(fā)的全球首 款CAR-T療法產(chǎn)品，于2017年8月被美國FDA批準(zhǔn)用于治療急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）兒童和青少年患者。此外，目前處于臨床試驗(yàn)階段的CAR-T療法多達(dá)300余種。

       圖9. 已上市和申請上市的CAR-T療法

       小結(jié)

       CAR-T細(xì)胞療法為血液腫瘤患者帶來了希望，尤其是在晚期惡性腫瘤患者治療中發(fā)揮重要作用。然而由于腫瘤免疫抑制微環(huán)境、抗原異質(zhì)性、脫靶毒 性等問題，阻礙了CAR-T療法的發(fā)展腳步。盡管存在挑戰(zhàn)，但新策略和潛在解決方案仍在不斷發(fā)展，并可能為更有效和更安全的抗癌療法提供前進(jìn)的方向和道路。此外，CAR-T高昂的治療費(fèi)用也是一座難以逾越的大山。相信隨著CAR-T療法的不斷研究，會(huì)有更多安全有效的CAR-T療法獲批上市，使患者獲益。

       參考文獻(xiàn)

       1、T cell immunotherapy for human cancer. Science. 2018, 359, 1361–1365.

       2、Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N. Engl. J. Med. 2017, 377, 2531–2544.

       3、Engineering CAR-T cells: design concepts. Trends Immunol. 2015, 36, 494–502.

       4、Engineering strategies to overcome the current roadblocks in CAR T cell therapy. Nat. Rev. Clin. Oncol .2020,17, 147–167.

       5、CAR T cell therapy in B cell acute lymphoblastic leukemia. Sci. Transl. Med. 2014, 6, 224-225.

       6、A safe and potent anti-CD19 CAR T cell therapy. Nat. Med. 2019, 25, 947–953.