眾所周知，傳統(tǒng)的抗體-藥物偶聯(lián)物（ADCs）通常需要內(nèi)化到癌細(xì)胞中以釋放其細(xì)胞毒有效載荷。目前全球一共有14個(gè)ADC藥物獲批上市。當(dāng)下，ADC藥物已發(fā)展成為繼小分子藥物、單克隆抗體后的新一代靶向抗癌藥物。

       然而，這類(lèi)ADC藥物往往需要腫瘤靶點(diǎn)具有高表達(dá)的內(nèi)化抗原和高效的細(xì)胞內(nèi)裂解活化效率，這對(duì)于腫瘤靶向治療的發(fā)展帶來(lái)了諸多限制。因此，研究人員開(kāi)發(fā)了一種新型的研發(fā)策略-非內(nèi)化ADC設(shè)計(jì)策略。通過(guò)這種方法，有效載荷可以在與內(nèi)化不良的抗原或其他腫瘤成分結(jié)合時(shí)從可裂解的連接物中釋放出來(lái)。這不僅消除了對(duì)高抗原表達(dá)的依賴(lài)，避免了潛在的低效內(nèi)化，還可以極大地?cái)U(kuò)展腫瘤靶點(diǎn)的范圍，包括：細(xì)胞外腫瘤基質(zhì)相關(guān)靶點(diǎn)。

       本文介紹了近年來(lái)非內(nèi)化ADCs的最新研究進(jìn)展。此外，還介紹了腫瘤相關(guān)的細(xì)胞表面和細(xì)胞外蛋白、腫瘤間質(zhì)靶向性和使細(xì)胞外有效載荷釋放的連接化學(xué)。

       ADCs介紹

       1  背景介紹

       抗體-藥物偶聯(lián)物（ADCs）是一類(lèi)腫瘤治療藥物，通過(guò)與高度特異性的單克隆抗體結(jié)合提供靶向藥物傳遞（圖1）。這種藥物結(jié)合了抗體的靶向能力和小分子藥物的細(xì)胞毒 性。與ADCs的典型作用機(jī)制不同，本文側(cè)重于介紹不需要內(nèi)在療效的ADCs。

       圖1. 一種ADC的結(jié)構(gòu)及可替代抗體的模板

       2  非內(nèi)化ADC的作用機(jī)制

       ADC通常被設(shè)計(jì)為通過(guò)內(nèi)部化的機(jī)制發(fā)揮作用：抗體與癌細(xì)胞上的靶抗原結(jié)合后，ADC通過(guò)內(nèi)吞作用內(nèi)化，然后在溶酶體中降解，釋放細(xì)胞毒有效載荷（圖2A)。如果有效載荷具有適當(dāng)?shù)哪ね感?，它可以擴(kuò)散出釋放它的細(xì)胞，進(jìn)入周?chē)?ldquo;旁觀者”癌細(xì)胞，這些癌細(xì)胞可能表達(dá)或可能不表達(dá)目標(biāo)抗原（稱(chēng)為旁觀者效應(yīng)）。雖然這種方法是成功的，（事實(shí)上，目前FDA批準(zhǔn)的所有ADC都使用內(nèi)化抗體），但它確實(shí)存在一定的局限性，如依賴(lài)內(nèi)化抗原的過(guò)度表達(dá)不是許多腫瘤的特征。此外，抗體是大分子蛋白質(zhì)，因此由于擴(kuò)散緩慢，對(duì)腫瘤的滲透也比較有限。

       先前的理論認(rèn)為內(nèi)化對(duì)ADC的治療至關(guān)重要，但越來(lái)越多的研究表明替代作用機(jī)制可能會(huì)更加有效。不需要溶酶體降解來(lái)釋放細(xì)胞內(nèi)的有效載荷，抗體-藥物連接可以設(shè)計(jì)成在細(xì)胞外腫瘤環(huán)境中不穩(wěn)定（圖2B)。這利用了癌癥與健康組織相比的獨(dú)特的化學(xué)或酶環(huán)境。細(xì)胞外釋放的有效載荷可以擴(kuò)散到周?chē)陌┘?xì)胞中，發(fā)揮其細(xì)胞毒 性作用。非內(nèi)化作用機(jī)制可能會(huì)擴(kuò)大腫瘤靶點(diǎn)的范圍，因?yàn)樗懦藘?nèi)化ADCs的嚴(yán)格要求，如高內(nèi)化抗原表達(dá)。事實(shí)上，一些非內(nèi)化的ADCs可以針對(duì)大多數(shù)侵襲性癌癥常見(jiàn)的生理腫瘤特征，因此可能是一種有希望的廣譜抗癌方法。有效載荷在細(xì)胞外的釋放也可使抗癌劑更深地滲透到腫瘤中，這是由于抗癌劑與抗體相比易于擴(kuò)散，并可使?jié)撛诘呐杂^者效應(yīng)最大化。

       圖2. (A)內(nèi)化ADC的機(jī)制 (B)非內(nèi)化ADC的機(jī)制

       靶抗原的多種特征在決定ADCs的成功中很重要。例如，目標(biāo)靶抗原在靶癌細(xì)胞上高表達(dá)，但不在健康細(xì)胞上高表達(dá)，以確保治療的特異性和避免脫靶毒 性?？贵w-抗原結(jié)合相互作用的性質(zhì)決定了構(gòu)建體是否發(fā)生內(nèi)化（以及多快）。為了成功地內(nèi)化ADCs，抗體必須快速誘導(dǎo)受體內(nèi)化、內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)和溶酶體加工（圖2A)

       相反，對(duì)于非內(nèi)化的ADCs，由于內(nèi)化不需要在抗體結(jié)合后以相當(dāng)大的速度發(fā)生，這些需要在細(xì)胞內(nèi)完成的步驟可以忽略。隨著人們對(duì)非內(nèi)化ADC的探索，與此同時(shí)越來(lái)越多的抗體-抗原相互作用內(nèi)化不良的病例也被不斷地發(fā)現(xiàn)。

       3  非內(nèi)化ADCs對(duì)抗B細(xì)胞抗原的機(jī)制

       作為對(duì)多種ADCs作用機(jī)制研究的一部分，Polson等人檢查了非內(nèi)化ADCs對(duì)抗B細(xì)胞CD20、CD21和CD72抗原的可行性。

       在這項(xiàng)工作中，他們用含有二硫化物或Val-Cit二肽的不可裂解或可裂解連接體生成了多種ADCs。他們發(fā)現(xiàn)，可裂解的二硫化物ADCs即使對(duì)體內(nèi)內(nèi)化非常差的抗原靶點(diǎn)CD20、CD21和CD72也很有效。假設(shè)二硫鍵可以在細(xì)胞外裂解，從而發(fā)揮非內(nèi)化機(jī)制的作用。同樣在這項(xiàng)工作中，含有Val-Cit連接體的Anticd21 ADC的MMAE有效載荷被MMAF取代，MMAF是一種含有帶電羧酸末端的類(lèi)似物（圖3C)，它阻礙了它在細(xì)胞膜上的擴(kuò)散能力。這一變化消除了ADC的活性，表明釋放的有效載荷在細(xì)胞膜上的擴(kuò)散對(duì)活性至關(guān)重要，從而支持了所提出的細(xì)胞外作用機(jī)制。顯然，這一數(shù)據(jù)與二硫化物和Val-Cit可裂解連接體需要內(nèi)化才能釋放有效載荷的經(jīng)典觀點(diǎn)相矛盾，并證明了在細(xì)胞外的連接體裂解是可能的。

       圖3.(圖A)Polson等人研究抗多種B細(xì)胞抗原的ADCs文庫(kù)(圖B)與抗體結(jié)合的連接體結(jié)構(gòu)（C）常見(jiàn)的細(xì)胞毒素藥物

       非內(nèi)化ADC的靶向部位及作用

       1  靶向膜蛋白

       PD-L1:

       程序性細(xì)胞死亡配體1(PD-L1)是一種跨膜蛋白，它與T細(xì)胞表面的程序性細(xì)胞死亡蛋白-1結(jié)合，抑制T細(xì)胞功能，使癌細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)。PD-L1在各種類(lèi)型的實(shí)體癌中表達(dá)上調(diào)，并常與預(yù)后不良和生存率降低有關(guān)。目前已有三種抗PD-L1的抗體獲得FDA批準(zhǔn)：Avelumab（默克）、Atezolizumab（羅氏）和Durvalumab（阿斯利康）。由于PD-L1的瞬時(shí)和異質(zhì)性表達(dá)以及大量抗體在致密的腫瘤間質(zhì)中的穿透性差，使得這些抗體在治療腫瘤受到了比較大的限制。因此，非內(nèi)化的ADC方法是具有吸引力的，因?yàn)榧?xì)胞外有效載荷釋放可以克服這些問(wèn)題。雖然在以前的研究中觀察到可裂解的Val-Cit連接子在細(xì)胞外裂解，但在本研究中需要內(nèi)化，可能是因?yàn)榧?xì)胞外連接子裂解的水平不確定。在細(xì)胞系、腫瘤類(lèi)型之間，甚至在臨床前小鼠模型和人類(lèi)之間，細(xì)胞外蛋白酶或其他連接物觸發(fā)物的水平是不同的。因此，體外和體內(nèi)應(yīng)用細(xì)胞外可裂解連接物可能需要逐案驗(yàn)證可用內(nèi)源性觸發(fā)物的水平。

       CEACAM5：

       癌胚抗原細(xì)胞黏附分子5(CEACAM5)是許多類(lèi)型癌癥的生物標(biāo)志物，通常不會(huì)明顯內(nèi)化。靶向該抗原在臨床前腫瘤模型中成功得到驗(yàn)證，利用pH敏感的碳酸酯或酯連接物在細(xì)胞外酸性腫瘤微環(huán)境中從ADCs釋放SN-38。

       Goldenberg等人研究了抗CEACAM5拉貝妥珠單抗ADCs在人結(jié)腸癌、人胰 腺腫瘤和全身性淋巴瘤異種移植瘤小鼠模型中的活性。所有ADCs都含有不耐酸的碳酸鹽或酯部分的連接物，一些底物具有額外的蛋白酶可分離的苯丙氨酸-賴(lài)氨酸（Phe-Lys）殘基（圖5）。幸運(yùn)的是，盡管CEACAM5的內(nèi)化性很差，但24個(gè)ADCs在CEACAM5陽(yáng)性的淋巴瘤腫瘤靶模式中誘導(dǎo)了100%的存活率，其中具有雙重可裂解接頭CL2（圖5）的ADCs在體內(nèi)的表現(xiàn)最好。作者提出了一種非內(nèi)化的作用機(jī)制，即SN-38從ADC細(xì)胞外緩慢釋放，允許游離藥物的高局部積累。相對(duì)較高的碳酸鹽/酯鍵活性被認(rèn)為適合與SN-38一起使用，因?yàn)榕c金葡素或美坦辛類(lèi)有效載荷相比，SN-38具有中等的細(xì)胞毒 性，允許藥物輕松釋放，而沒(méi)有明顯的脫靶毒 性。事實(shí)上，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的ADC Trodelvys含有通過(guò)CL2A連接體結(jié)合的SN-38（圖5C)。盡管它的目標(biāo)是高度內(nèi)化抗原troP-2，但用高度穩(wěn)定的連接取代CL2A連接體顯著減少了E-cacy，表明從CL2A連接體中逐漸釋放SN-38有助于E-cacy。

       圖4. 抗CEACAM5非內(nèi)化ADCs的結(jié)構(gòu)

       圖5. FDA批準(zhǔn)的ADCs的結(jié)構(gòu)包括其抗原靶點(diǎn)、腫瘤適應(yīng)癥、連接子結(jié)構(gòu)、有效載荷和切割機(jī)制。

       NKA ：

       NKA是對(duì)所有細(xì)胞的功能至關(guān)重要的質(zhì)膜離子泵：因此，NKA的抑制會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。與經(jīng)典的ADC方法不同，作者沒(méi)有開(kāi)發(fā)針對(duì)NKA的抗體（對(duì)健康細(xì)胞沒(méi)有特異性），而是利用了其他癌癥相關(guān)蛋白與NKA的接近性。Dydapherin是一種細(xì)胞膜糖蛋白，在許多轉(zhuǎn)移癌中過(guò)度表達(dá)，并與NKA相互作用。將NKA的強(qiáng)心苷抑制劑與抗Dydapherin抗體結(jié)合，使抗體抗原與Dydapherin結(jié)合，使抑制劑與NKA非常接近。與NKA結(jié)合的抑制劑通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞腫脹和隨后的膜破裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡（圖6）。有趣的是，這種策略因?yàn)榕懦诉B接子裂解，抑制劑在附著于抗體的同時(shí)也作用于細(xì)胞外。

       圖6.NKA抑制非內(nèi)化性ADC的作用機(jī)制

       2  靶向腫瘤微環(huán)境

       在不利用膜抗原的情況下靶向腫瘤的替代策略現(xiàn)已出現(xiàn)。依賴(lài)靶向膜抗原有幾個(gè)缺點(diǎn)：因?yàn)楹苌儆邪┌Y均勻地過(guò)度表達(dá)抗原，而耐藥性可以通過(guò)抗原表達(dá)的變化獲得。取而代之的是，其他方法通過(guò)靶向細(xì)胞外腫瘤微環(huán)境的成分，如分泌的或細(xì)胞外蛋白，或靶向腫瘤基質(zhì)豐富的結(jié)締組織和血管，間接地尋求根除惡性細(xì)胞。

       3  靶向細(xì)胞外基質(zhì)蛋白

       Galectin-3-binding protein(Gal-3-BP)，廣泛存在于大多數(shù)腫瘤中，是腫瘤微環(huán)境靶向ADCs的一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)。亞科貝利等人研制了一種針對(duì)Gal-3-bp凝集素結(jié)合域的人源化抗體，通過(guò)直接與C-末端半胱氨酸和含硫的美坦辛類(lèi)藥物(DM1、DM3或DM4)形成混合二硫化物，以“無(wú)連接”的方式實(shí)現(xiàn)藥物的結(jié)合。Neri實(shí)驗(yàn)室首次描述了這種無(wú)鏈接技術(shù)，他證明細(xì)胞外空間中高濃度的還原劑有助于選擇性地裂解二硫化物，從而使細(xì)胞外藥物釋放。

       人們認(rèn)為，在有效載荷釋放和細(xì)胞死亡后，腫瘤微環(huán)境中釋放越來(lái)越多的還原劑，在“連鎖反應(yīng)”中導(dǎo)致有效載荷釋放和細(xì)胞死亡（圖7A和B）。因此，含抗Gal-3-BP二硫化物的ADCs在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制，DM3結(jié)合物在最 佳劑量的小鼠異種移植模型中實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)期和完全的緩解。

       圖7.非內(nèi)化抗Gal-3-BP ADC的結(jié)構(gòu)和機(jī)制

       4  靶向機(jī)制或腫瘤血管

       許多實(shí)性腫瘤表現(xiàn)出致密的細(xì)胞間基質(zhì)：結(jié)締組織和血管網(wǎng)絡(luò)，阻礙了大分子深入腫瘤（圖8）。這往往是ADC成功治療實(shí)體瘤的障礙。一個(gè)新的策略替代靶向位于基質(zhì)屏障后面的腫瘤細(xì)胞，是靶向基質(zhì)本身。ADC在基質(zhì)中的積累可以使腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外有效載荷釋放，然后擴(kuò)散到鄰近的腫瘤細(xì)胞中。由于小分子的擴(kuò)散大于單克隆抗體，使得活性藥物對(duì)實(shí)體瘤的滲透性有望得到改善。

       這被稱(chēng)為“癌癥基質(zhì)靶向治療”(CAST)。此外，經(jīng)典ADCs對(duì)幾種實(shí)體腫瘤（結(jié)直腸、肺、胰 腺）的治療由于其異質(zhì)性靶抗原表達(dá)而受到例了限制。因此，一種替代的靶向方法是修飾的腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)的成分包括膠原、纖維連接蛋白、和纖維蛋白，由于它們?cè)谀[瘤基質(zhì)或血管中的豐富度、穩(wěn)定性和選擇性，使得他們可以成為具有非常具有吸引力的靶標(biāo)。

       圖8.（圖A）經(jīng)典內(nèi)化ADCS治療有致密細(xì)胞外基質(zhì)的實(shí)性腫瘤。（圖B）腫瘤基質(zhì)靶向治療(CAST)的方法。

       外源性觸發(fā)細(xì)胞外釋放

       雖然大多數(shù)ADC依賴(lài)于內(nèi)源性觸發(fā)物釋放有效載荷，如腫瘤相關(guān)酶或不同的腫瘤pH值，但已開(kāi)發(fā)出一種新的替代方法，即從ADC中單獨(dú)外源引入小分子觸發(fā)物。在給藥可裂解的、非內(nèi)化的ADC后，允許ADC與靶抗原結(jié)合的時(shí)間，以及從血液中清除任何未結(jié)合的、未靶向的ADC以抵消離靶效應(yīng)的時(shí)間。隨后，給予外源性釋放觸發(fā)器，僅激活作用位點(diǎn)處的ADC（圖9）。

       與傳統(tǒng)的ADCs不同，這種方法不依賴(lài)于自然生物激活機(jī)制的切割，如有效載荷釋放的某些酶的存在或特定濃度，這可能在癌癥和患者之間存在很大差異。因此，生物正交活化可以允許更可預(yù)測(cè)的藥物釋放速率，空間和時(shí)間控制。

       圖9.外源激活A(yù)DCs的作用機(jī)制。（這里顯示的是以Diabody格式靶向細(xì)胞外蛋白的抗體。在ADC從血液中清除后，小分子外源性激活劑僅在作用部位被給予以引起連接體裂解和有效載荷釋放）。

       腫瘤相關(guān)糖蛋白72(TAG72)在多種實(shí)體腫瘤的癌細(xì)胞表面會(huì)發(fā)生過(guò)度表達(dá)。Rossin等人已經(jīng)證明了它作為非內(nèi)部化ADC靶向的適用性。WHO利用生物正交逆電子需求Diels Alder(IEDDA)反應(yīng)生成非內(nèi)化抗TAG-72 ADC。在ADC中加入反式環(huán)辛烯連接體，使外源給藥的小分子四嗪探針能夠輕松地“點(diǎn)擊釋放”化學(xué)。隨后一個(gè)噠嗪消除反應(yīng)被觸發(fā)，允許烯丙基氨基甲酸酯從反式環(huán)辛烯中裂解，釋放游離的含胺的細(xì)胞毒素（圖10）。因此，產(chǎn)生非內(nèi)化ADC，該ADC可在通過(guò)外源觸發(fā)器切割連接子后在細(xì)胞外釋放有效載荷。

       在引入外源性探針之前，需要清除血液中未結(jié)合的ADC，以避免脫靶激活和有效載荷釋放而導(dǎo)致的全身毒 性。因此，作者使用Diabody格式的ADCs由于清除速度更快，腫瘤穿透更深。在保留高腫瘤定位的情況下，與MMAE的Diabody-結(jié)合物在2天后給予四嗪點(diǎn)擊激活劑，給予細(xì)胞外激活和MMAE釋放。在健康的非靶組織中，Diabody-結(jié)合物的低保留提供了高的腫瘤選擇性。在體內(nèi)，TAG-72非內(nèi)化點(diǎn)擊釋放Diabody ADC與具有Val-Cit可裂解連接體的TAG-72 Diabody-ADC的類(lèi)似物進(jìn)行了比較。在體內(nèi)觀察到點(diǎn)擊釋放ADC改善了腫瘤生長(zhǎng)抑制，EC50s分別為185和35 pm（在結(jié)直腸和卵巢癌異種移植中）。

       相反，val-cit ADC由于MMAE的胞外釋放有限而對(duì)腫瘤生長(zhǎng)抑制無(wú)效。說(shuō)明點(diǎn)擊釋放策略耐受性良好，使用ADC、四嗪活化劑或其組合并沒(méi)有產(chǎn)生毒 性。盡管這種方法需要臨床上開(kāi)發(fā)兩種不同的成分（ADC和激活劑），但預(yù)計(jì)該方法可以使用相同的激活劑應(yīng)用于廣譜癌癥靶點(diǎn)（如許多實(shí)體腫瘤中存在的基質(zhì)成分）。

       總之，作者證明了IEDDA噠嗪消除的適用性，以允許時(shí)間控制和無(wú)痕跡的ADC連接子裂解，激活有效載荷釋放僅在細(xì)胞外的位點(diǎn)分泌，而不依賴(lài)于內(nèi)源性腫瘤生物學(xué)效應(yīng)。

       圖10.（圖A）反環(huán)辛烯與四嗪類(lèi)外源激活劑的點(diǎn)擊反應(yīng)致抗TAG72非內(nèi)化ADC“點(diǎn)擊釋放”的結(jié)構(gòu)和機(jī)制。（圖B）連接體的結(jié)構(gòu)(C)四嗪外源激活劑的結(jié)構(gòu)

       總結(jié)

       在過(guò)去十年的ADC研究中，越來(lái)越多的注意力轉(zhuǎn)向開(kāi)發(fā)具有細(xì)胞外有效載荷釋放機(jī)制的非內(nèi)化ADC，目的是改善經(jīng)典內(nèi)化ADC相關(guān)的一些缺點(diǎn)。例如，它們對(duì)高、同質(zhì)抗原表達(dá)的依賴(lài)，將許多其他癌癥類(lèi)型排除在靶點(diǎn)選擇之外等問(wèn)題。因此，非內(nèi)化ADCs代表了一種新的希望，可以通過(guò)非內(nèi)化ADCs來(lái)有效治療更廣泛的缺乏合適抗原表達(dá)的癌癥。

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