輝瑞是率先專注JAK抑制劑的制藥巨頭，其有完備的JAK抑制劑研發(fā)管線，并且成功推出了全球首個(gè)上市的JAK抑制劑托法替尼。2018年9月，輝瑞公司宣布，其研發(fā)的口服Janus激酶3(JAK3)抑制劑PF-06651600用于治療斑禿獲得了美國食品和藥物管理局(FDA)突破性療法的認(rèn)定(breakthroughtherapy designation)，為全球斑禿患者帶來新的曙光。目前，PF-06651600治療斑禿的Phase III 臨床實(shí)驗(yàn)(NCT04006457, NCT03732807)正在進(jìn)行當(dāng)中。隨著臨床實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)制備PF-06651600的初始路線已不能滿足臨床實(shí)驗(yàn)API的需求。為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模，快速，穩(wěn)定地制備臨床實(shí)驗(yàn)所需API原料，新的工藝路線亟待開發(fā)。

       PF-06651600初始合成路線

       如圖一所示，PF-06651600初始合成路線以6-甲基3-胺基吡啶(2)作為起始物料，經(jīng)Boc保護(hù)得到化合物3。而后，以貴金屬P_tO₂作為催化劑，在55 psi H₂下，于50°C乙酸溶液中完成氫化，得到外消旋哌 啶rac-4，順式/反式比例為2/1。將rac-4哌 啶N原子以Cbz保護(hù)基進(jìn)行保護(hù)，分別得到2∶1的順式rac-5和反式rac-6混合物。接著，以手性超臨界流體色譜法(SFC)對(duì)該非對(duì)映異構(gòu)體混合物進(jìn)行分離，得到順式rac-5。將獲得的rac-5在二氯甲烷溶液中以HCl除去N-Boc基團(tuán)，得到鹽酸鹽形式的 rac-7。rac-7·HCl與2,4二氯吡咯并嘧啶8之間進(jìn)行親核取代反應(yīng)得到中間體rac-9。隨后9在Pd/C催化下進(jìn)行氫化，同時(shí)除去N-Cbz保護(hù)基和2-氯取代基，得到rac-10。在Schotten-Baumann條件下用丙烯酰氯與rac-10反應(yīng)，粗產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析純化得到目標(biāo)化合物消旋體（rac-1）。最終，經(jīng)再一次手性SFC分離得到光學(xué)純的1。輝瑞研發(fā)人員通過該路線共提供了約60 g 目標(biāo)產(chǎn)物1（純度約95％，ee≥98％）。該路線最大產(chǎn)量為40 g，總收率為5％，可支持生物活性測(cè)定，ADME評(píng)估和早期毒理學(xué)研究。

       圖一 PF-06651600初始合成路線

       工藝路線的優(yōu)化策略

       引入具有邁克爾加成受體官能團(tuán)(如丙烯酰胺官能團(tuán))的API是一種常見的藥物設(shè)計(jì)策略。但是這類API化合物面臨的挑戰(zhàn)在開發(fā)的早期就顯而易見，其在制備，純化，儲(chǔ)存中可觀察到由于邁克爾加成而產(chǎn)生的雜質(zhì)。由于化合物1以無定形游離堿的形式存在，這加劇了邁克爾加成雜質(zhì)的生成。

       在最后一步API合成步驟中，研究人員分離鑒別了三種主要雜質(zhì)，其中11和12是與工藝相關(guān)的雜質(zhì)，可以通過純化1除去。然而，邁克爾加成雜質(zhì)13卻可隨著時(shí)間的推移而有所增加。

       圖二 API合成步驟中的主要雜質(zhì)

       為了在改善路線經(jīng)濟(jì)性和提高API交付速度之間取得平衡，研究人員認(rèn)為需要解決早期開發(fā)階段出現(xiàn)的以下問題：

       (1)尋找經(jīng)濟(jì)有效的氫化條件以還原吡啶中間體，同時(shí)改善順/反立體選擇性；

       (2)確定可擴(kuò)大化生產(chǎn)的經(jīng)典拆分方法，以在合成路線早期分離富對(duì)映體(enantioenriched)的哌 啶，從而避免手性色譜分離；

       (3)提高丙烯酰胺合成步驟收率；

       (4)規(guī)避所有的色譜純化步驟；

       (5)確定1的穩(wěn)定晶型并且開發(fā)可靠的結(jié)晶過程對(duì)其進(jìn)行分離。

       PF-06651600工藝路線優(yōu)化

       經(jīng)典拆分方法制備中間體7

       為提高中間體3的收率，研究人員優(yōu)化了Boc酸酐投料量以及反應(yīng)溫度。另外，將反應(yīng)溶劑從乙醇變成THF與氯化銨水溶液（含有6當(dāng)量的水和0.03當(dāng)量的NH4Cl）的混合體系，可以抑制脲基副產(chǎn)物16的形成。通過庚烷/乙酸乙酯體系中重結(jié)晶，以95％分離產(chǎn)率得到中間體3，純度> 99.5％。

圖三 工藝路線中確證的雜質(zhì)

       目前，使用均相Rh或Ir催化劑通過不對(duì)稱氫化將吡啶對(duì)映選擇性還原為哌 啶的實(shí)例不多，而以2,5-二取代吡啶作為底物使不對(duì)稱氫化更具挑戰(zhàn)性。在經(jīng)初步的評(píng)估之后，研究人員將重點(diǎn)轉(zhuǎn)向在外消旋氫化條件下替換昂貴的P_tO₂催化劑，并盡可能地提高順式/反式非對(duì)映異構(gòu)體的比例。最終，選擇使用5％Rh / C作為催化劑，在50℃，50 psi氫氣壓力下，于乙醇/乙酸為9：1的混合溶劑體系中進(jìn)行該反應(yīng)。該條件不僅使順/反比提高到2.8：1，而且在大規(guī)模生產(chǎn)中可重現(xiàn)性更好。使用該反應(yīng)條件，研究人員在10h內(nèi)成功完成了對(duì)＞100Kg 中間體3的氫化。在反應(yīng)完成后，通過與正庚烷共沸蒸餾將乙酸部分除去，得到粗品rac-4無色溶液（乙醇/乙酸=20:1），直接用于下一步拆分。

圖四 中間體7的合成路線

       研究人員共篩選了91種手性酸，最終選擇以(R)-2-(3，5-二硝基苯甲酰胺基)-2-苯基乙酸14作為拆分劑。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，采用高速攪拌和添加高純度中間體15作為晶種的方法可以提高中間體15的光學(xué)純度。當(dāng)結(jié)晶的漿液在70℃下攪拌時(shí)間由3h增加到16 h時(shí)，觀察到產(chǎn)品ee值從 98%下降到91%。這表明結(jié)晶過程存在一個(gè)動(dòng)力學(xué)過程，其對(duì)映選擇性高于熱力學(xué)平衡所能提供的對(duì)映選擇性。因此，為了保證重現(xiàn)性，研究人員開發(fā)了以下流程：首先向70°C 的14（0.45當(dāng)量）乙醇溶液中加入少量中間體15晶種，然后在高速攪拌下將rac-4溶液緩慢滴加至該體系中，得到15的白色漿液。而后將白色漿液在70°C下攪拌不超過3.5小時(shí)，并在5小時(shí)內(nèi)線性冷卻至22°C。離心得到15白色固體，ee為97.1%。 將得到的15在熱乙醇中進(jìn)行打漿純化，最終得到15的白色結(jié)晶固體，ee值99.1％。該流程在>50 kg規(guī)模多次重復(fù)驗(yàn)證。從3得到15的總產(chǎn)率為31％。

       由中間體15到7·HCl的三步轉(zhuǎn)化通過疊縮工藝(telescoped process)完成。首先用MTBE與 NaOH水溶液中和15，得到順式-4游離堿的MTBE溶液。而后得到Cbz保護(hù)的中間體5。將溶劑從MTBE替換為乙酸異丙酯，通過HCl的甲醇溶液除去N-Boc基團(tuán)，得到7·HCl，并進(jìn)一步在 MTBE體系中結(jié)晶析出。該流程能夠以80％的產(chǎn)率獲得白色粉末狀的7·HCl，同時(shí)提高產(chǎn)品的順式/反式比例（100％順式）和光學(xué)純度（99.8％ee）。

       中間體10的合成

       中間體7與8在水和MIBK雙相體系（5：1（v / v））中進(jìn)行親和反應(yīng)，以K2CO3（3.2當(dāng)量）作為堿合成中間體9。該反應(yīng)在90℃下進(jìn)行22小時(shí)。 反應(yīng)完成后，用乙酸乙酯萃取產(chǎn)物9，共沸除去大部分MIBK后，在甲醇和水的混合溶劑中結(jié)晶。進(jìn)一步研究表明，殘留的甲醇可在隨后的氫解步驟中生成N-甲基化雜質(zhì)17。該雜質(zhì)是通過甲醇脫水為甲醛，甲醛與N反應(yīng)生成亞胺后還原而形成的。在氫不飽和的條件下，如在沒有清除二氧化碳副產(chǎn)物或高催化劑負(fù)載下（支持脫水成甲醛），會(huì)增加17的生成。但是氫氣本身也促進(jìn)17的產(chǎn)生（ 還原胺化的機(jī)理）。為避免形成17，研究人員將中間體9在水中進(jìn)行打漿，然后干燥，以確保除去殘留的甲醇。該步驟產(chǎn)率約為89％，純度大于99.5％，可實(shí)現(xiàn)最大規(guī)模100Kg產(chǎn)品的制備。

圖五 中間體10的合成路線

       在原合成工藝中，使用干燥的Pd/C催化劑在甲醇/THF體系中進(jìn)行的氫解反應(yīng)經(jīng)常不能使使氯化物完全氫解，因此常需要將反應(yīng)物過濾后再用催化劑進(jìn)行第二輪氫解，以實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化。 經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)，使用10％的Pd(OH)2/C濕催化劑，在丁醇和水體系下能夠更高效的完成氫化。反應(yīng)完成后，過濾反應(yīng)液除掉催化劑，然后用甲醇稀釋。用氫氧化鈉中和體系中的鹽酸，并使產(chǎn)物結(jié)晶為一水合物(10·H2O)。在50kg條件下，10·H2O的收率為89%，純度為99.7%。

       API的合成

       對(duì)于API的合成步驟，研究人員工作重點(diǎn)是確定更好的?；噭瑝A和有機(jī)溶劑，同時(shí)盡量在Schotten?Baumann條件下進(jìn)行反應(yīng)。研究者選擇已商業(yè)化的丙烯酰氯和3-氯丙酰氯作為酰化劑對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行篩選，二者最優(yōu)反應(yīng)條件分別列于表一中。通過比較這兩種方法發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中間體10與3-氯丙酰氯?；纬芍虚g體11時(shí)，產(chǎn)物1的濃度最低，因此可避免產(chǎn)物1與10反應(yīng)生成雜質(zhì)12。由于11到1的部分轉(zhuǎn)化，最終反應(yīng)混合物中僅觀察到1％副產(chǎn)物12。與此相反，丙烯酰氯直接?；?的反應(yīng)體系生成了10%的副產(chǎn)物12，這可能是因?yàn)楫a(chǎn)物1的濃度太高導(dǎo)致其與10的反應(yīng)速度變快。類似地，在B條件下，雜質(zhì)13的初始含量(形成速度比12慢)也降低了約90%。

       表一 ?；噭┑暮Y選

       而后，在條件B的反應(yīng)混合物中加入2 N NaOH（3.05當(dāng)量）水溶液，20°C攪拌20h，化合物 11能夠順利地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物1，同時(shí)其他雜質(zhì)（包括13）生成較少。反應(yīng)終點(diǎn)化合物11：12：1：13的分布為0.2％：1.1％：93.5％：0.2％。另外，AMES測(cè)試表明，中間體11不是遺傳**雜質(zhì)，可被視為正常的工藝雜質(zhì)。綜上所述，條件B被選擇作為放大生產(chǎn)的工藝路線，并在50 kg規(guī)模上證明了其可重復(fù)性。

圖六 API合成步驟

       在得到中間體11后，研究人員開發(fā)了一種帶有部分純化功能的后處理方式，以提供1的游離堿。在消除反應(yīng)完成后，首先加入KH₂PO₄ (5.3 equiv)調(diào)節(jié)pH至6.5，鹽水洗滌，有機(jī)相純度提高到96.2%。將溶劑從THF切換到MEK后，與硅膠(130 wt %)、MgSO4 (30 wt %)、活性炭Darco G-60 (15 wt %)攪拌，進(jìn)一步純化，過濾。濾液濃縮后，得到1在MEK中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 wt %的溶液，純度為98.5%，產(chǎn)率為81%。由于1不穩(wěn)定，且在高溫下易生成雜質(zhì)13，因此路線中所有蒸餾操作都是在低溫(<30℃)下進(jìn)行并盡量縮短1的儲(chǔ)存時(shí)間。

       為了使API能夠更加穩(wěn)定，研究人員進(jìn)一步篩選了眾多化合物1的鹽，并最終確定以對(duì)甲苯磺酸與1成鹽。最初的3Kg規(guī)模放大使用了1的30 wt％的MEK溶液，該溶液已在10°C下保存了3周，純度從98.5％降至98.0％，二聚體雜質(zhì)13從0.2％升高至0.5％。在成鹽之前，首先用SiO₂（25 wt％）對(duì)該溶液進(jìn)行預(yù)處理以除去部分雜質(zhì)13（0.5％至0.2％）和其他少量未鑒定的雜質(zhì)。而后，將MEK和水添加到此預(yù)處理后的1的MEK溶液中，并滴加TsOH·H₂O（1.1當(dāng)量）的MEK溶液。此時(shí)，水和MEK的溶劑組成為5.3％∶94.7％（w/w）。加入晶種（4wt％）后，將混合物高速攪拌以形成分散良好的白色漿液。緩慢加入MEK使溶劑組成達(dá)到2.3％∶97.7％（w / w）。過濾該混合溶液得到白色固體，產(chǎn)率為89％，純度約99.6％。由化合物10到成鹽的兩步反應(yīng)經(jīng)多批> 50 kg制備得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。該工藝路線制備的PF-06651600甲苯磺酸鹽為API儲(chǔ)存和片劑制劑均提供了令人滿意的穩(wěn)定性。

       結(jié)語

       通過工藝的持續(xù)改進(jìn)，路線總收率從5％提高到14％，并且已經(jīng)生產(chǎn)了多批次公斤級(jí)的API產(chǎn)品，為正在進(jìn)行的臨床研究提供了有力的支撐。

       參考文獻(xiàn)

       1. ACS Chemical Biology, 2019, 14(6), 1235-1242.

       2. Org. Process Res. Dev., 2019, 23, 1872-1880.

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